金匮肾气丸化裁方对良性前列腺增生大鼠前列腺组织VEGF、IGF-1表达的影响※

张喜奎 卢志铨 吴 栋

实验研究

金匮肾气丸化裁方对良性前列腺增生大鼠前列腺组织VEGF、IGF-1表达的影响※

张喜奎1卢志铨2吴 栋2

（1福建中医药大学附属第二人民医院，福州350004；2福建中医药大学，福州350108）

目的研究金匮肾气丸化裁方对大鼠前列腺增生模型前列腺组织VEGF和IGF-1表达的影响。方法去势加丙酸睾酮注射法建立大鼠前列腺增生模型，免疫组化学法检测前列腺组织中血管内皮生长因子（VEGF）的表达，RT-PCR法检测类胰岛素生长因子-1（IGF-1）mRNA的水平。结果金匮肾气丸化裁方中剂量组明显降低前列腺增生组织中VEGF和IGF-1 mRNA的水平。结论金匮肾气丸化裁抑制大鼠前列腺增生可能与调控生长因子表达水平有关。

金匮肾气丸；良性前列腺增生；VEGF；IGF-1

良性前列腺增生症（Benign prostatic hyperlasia，BPH）是老年男性的常见病、多发病之一。目前，现代医学对BPH的治疗主要采用药物和手术等方法治疗，但药物治疗效果并非很理想，手术、激光、尿道内支架等方法也都存在一定的并发症［1］。有学者运用肾气丸［2-4］加减治疗BPH，取得了一定的疗效，笔者在临床中选用金匮肾气丸化裁方治疗BPH亦取得了满意的疗效。本实验选用金匮肾气丸化裁方对大鼠BPH模型进行干预，分别采用免疫组织化学法及RT-PCR法检测前列腺组织中VEGF、IGF-1的表达水平，进而探讨金匮肾气丸化裁方治疗BPH的作用机理。

1 材料与方法

1.1实验动物Wistar大鼠，雄性，体重180～220g，共60只，从上海斯莱克实验动物有限公司购进［许可证号：SCXK（沪）2012-0002］，在福建中医药大学动物实验中心［许可证号：SYXK（闽）2009-0001］进行饲养。

1.2主要药物与试剂①非那雄胺片：由杭州默沙东制药有限公司生产，5mg／片（产品批号：322787）；②金匮肾气丸化裁方：干地黄24g，山萸肉12g，山药12g，泽泻9g，牡丹皮9g，茯苓6g，附子3g，桂枝3g，益母草10g，川牛膝10g，荔枝核12g。剂量参考新世纪《方剂学》、《中药学》本科教材及临床用药经验，中药饮片由福建中医学院国医堂提供。全方水煎提取浓缩至2g／mL，4℃保存备用；③丙酸睾酮注射液：由上海通用药业股份有限公司生产，25mg／ml（产品批号：120102）；④VEGF免疫组化检测试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司提供；⑤二步法免疫组化试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司提供。⑥RT-PCR试剂盒：CWBIO公司提供。⑦溶媒：橄榄油，市售。

1.3主要仪器①离心机KDC-2046；②洗板机ELX-50；③石蜡切片机LEICA 2135；④光学显微镜OLYMPUS BX40；⑤医学图像分析系统CMIAS-2001B；⑥组织匀浆器Bio Masher。⑦ABI 7500型荧光定量PCR仪。

1.4模型建立与分组取60只Wistar大鼠，雄性，体重180～220g，普通饲养观察1周，随机取10只为空白对照组（Ⅰ组），另外50只进行造模。造模方法按文献［5］并稍加改进。先用10%水合氯醛0.3m1／100g腹腔注射麻醉，常规消毒皮肤，经阴囊摘除双侧睾丸，术后肌内注射青霉素20万U／只。去势第7天随机分为病理模型组（Ⅱ组）、非那雄胺片（Ⅲ组）及中药低剂量组（Ⅳ组）、中药中剂量组（Ⅴ组）、中药高剂量组（Ⅵ组），每组10只。每日皮下注射丙酸睾丸酮5mg／（kg·d），诱导前列腺增生，空白对照组每日皮下注射等量生理盐水，连续28d。

1.5给药干预手术大鼠恢复7d后，开始为期28d的治疗。Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组分别给予中药低剂量、中药中剂量、中药高剂量灌胃，大鼠给药量按照人与大鼠体表面积法换算，低、中、高3个剂量组拟为临床等效量的0.5、1、2倍量。根据实际情况，原浓度2g／mL给药相当于实际给药量10g／kg。用蒸馏水作等比稀释后按照5m1／kg灌胃给药，每日1次。Ⅲ组给予非那雄胺片1mg／（kg·d）灌胃，Ⅰ组、Ⅱ组分别予等量生理盐水灌胃。每7d称重1次，根据体重调节给药剂量。

1.6标本采集给药4周后，用颈椎脱臼法处死大鼠，取出前列腺组织，一部分用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，用于VEGF检测，一部分迅速放入-80℃冰箱冷藏，用于IGF-1检测。

1.7观测指标及检测方法①一般情况：每日观察大鼠的精神状态、活动、被毛、二便、饮食等情况；治疗前后每周称体重一次；②免疫组织化学法检测前列腺组织中VEGF的表达：按ABC法常规步骤操作，阴性对照用PBS代替一抗。棕黄色染色为VEGF阳性表达。选取细胞分布均匀的高倍视野作为观察区，将镜下阳性细胞数同总细胞数相比较，得到阳性细胞的表达率。每张切片观察5个视野，取其平均值。③RT-PCR方法检测前列腺组织中IGF-1 mRNA的表达：超纯RNA提取试剂盒（CWbio.Co.Ltd，Cat＃CW0581）提取RNA，DNaseⅠ试剂盒（CWbio.Co.Ltd，Cat＃CW2090）对RNA中残留的基因组DNA进行消化处理。HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒（CWbio.Co.Ltd，Cat＃CW0744）进行逆转录合成cDNA。选取各样本cDNA分别用UltraSYBR Mixture（With ROX）（CWbio.Co.Ltd，Cat＃CW0956）进行实时扩增，采用荧光定量PCR仪实时定量，并形成扩增产物溶解曲线图，三孔重复CT值，取平均CT值，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。

1.8统计学分析方法与评价实验数据均采用平均值士标准差（x±s）表示，应用SPSS18.0统计软件包进行统统计分析，组间比较采用方差分析，P＜0.05差异具有统计学意义，P＜0.01为具有显著性差异。

2 结果

2.1一般情况观察空白对照组大鼠反应敏捷，神志、饮食、二便正常，皮毛致密而白净。病理模型组大鼠饮食减少，消瘦，皮毛蓬松，脊背毛色呈黄褐色，枯槁无光泽。中药低剂量组大鼠情况与病理模型组比较差别不大，其余各治疗组大鼠一般情况好于病理模型组。

2.2各组大鼠前列腺组织中VEGF的表达比较病理模型组与空白对照组相比，VEGF呈现出强阳性的表达反应，即模型大鼠前列腺增生发生、发展过程中，在前列腺组织中存在VEGF的过度表达；非那雄胺组、金匮肾气丸化裁方低、高剂量组与病理模型组比较虽有所减轻但远未达到正常，说明非那雄胺组、金匮肾气丸化裁方低、高剂量组能抑制VEGF表达，但效果不佳；而金匮肾气丸化裁方中剂量组能明显抑制VEGF的表达，且趋近于空白对照组的表现，见表1。

表1 各组大鼠前列腺组织中VEGF的表达比较 （x±s，n=10）

2.3各组大鼠前列腺组织中IGF-1 mRNA的表达比较与空白组相比，病理模型组IGF-1 mRNA表达升高最为显著；与模型组相比，中药低剂量组IGF-1 mRNA表达降低无差异（P＞0.05），非那雄胺组、高剂量组IGF-1 mRNA表达降低有差异（P＜0.05），中剂量组存在显著差异（P＜0.01）；与非那雄胺组相比，中药中剂量组IGF-1 mRNA表达降低存在显著差异（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠前列腺组织中IGF-1 mRNA的表达比较 （x±s）

3 讨论

现代生理学研究表明，前列腺组织中含有各种生长因子，这些生长因子与前列腺细胞的增殖与凋亡均有直接关系。正常情况下，生长促进因子与生长抑制因子的作用保持相对平衡，前列腺才能正常地发育、生长，并维持其结构与功能的完整［6］。VEGF是血管内皮细胞增殖过程中一个主要的正性调节因子［7］，有研究表明VEGF主要促进血管内皮增生并增加血管通透性，在BPH中呈高表达［8］。IGF-1是一种前列腺上皮细胞的有丝分裂原，对正常和转化的前列腺上皮细胞具有抗细胞凋亡和促有丝分裂的作用。有学者发现，IGF-1水平的高低与前列腺增生的程度呈正相关［9］。

良性前列腺增生多属中医“癃闭”“精癃”病症的范畴。中医认为，BPH基本病机是肾气亏虚，瘀血痰浊聚结，病性多为本虚标实、虚实夹杂。治疗上应标本兼顾，既重视肾气亏虚之本，又兼顾瘀血阻滞之标，充其肾气，化其瘀滞。金匮肾气丸化裁方由《金匮要略》肾气丸方加味而成，全方由干地黄、山萸肉、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓、附子、桂枝、益母草、川牛膝、荔枝核组成。诸药相合，共奏补益肾气，活血化瘀，缓消癓瘕之效。全方非常切合BPH的基本病机。

本实验免疫组化结果显示，模型组大鼠前列腺组织VEGF阳性表达率明显高于对照组，中药剂量组VEGF阳性表达率则明显低于模型组，而趋近于对照组，说明金匮肾气丸化裁方可以抑制VEGF的表达。RT-PCR荧光定量显示，IGF-1在模型组大鼠前列腺组织中表达水平明显高于对照组和中药中剂量组，而对照组与中药中剂量组之间无统计学差异，说明金匮肾气丸化裁方可以有效抑制BPH大鼠前列腺组织中IGF-1的表达。因此，通过调控生长因子表达水平，可能是金匮肾气丸化裁方抑制前列腺增生的作用机理。

［1］Harkaway RC，Issa MM.Medical and minimally invasive therapies for the treatment of benign prostatic hyperplasia［J］.Prostate Cancer Prostatic Dis，2006，9（3）：204-214.

［2］刘文兵.金匮肾气丸治疗前列腺增生症46例临床观察［J］.长春中医药大学学报，2009，25（2）：243.

［3］寿仁国.金匮肾气丸加味治疗前列腺增生122例［J］.江西中医药，2007，8（296）：31.

［4］刘艳.金匮肾气丸治疗前列腺增生症20例临床观察［J］.长春中医药大学学报，2009，25（4）：540.

［5］中华人民共和国卫生部药政局，新药（西药）临床前研究指导原则汇编［M］.北京：人民卫生出版社，1993：101-103.

［6］张玉海，邵强.前列腺外科［M］.北京：人民卫生出版社，2001，11：22-23

［7］Qian YY，Liu YQ.Inhibition of Celastrus orbiculatus extracts on VEGFexperssion in hepatoma cells of mice［J］.Chin Herb Med，2101，2（1）：72-76.

［8］邵继春，王毅，张蜀武，等.睾酮刺激大鼠前列腺增生模型的血管新生及调控因子研究［J］.中华男科学杂志，2005，11（6）：413-418.

［9］于静萍，吴秀梅，陈建国，等.良性前列腺增生病人血清IGF-1、IGFBP-3水平分析［J］.中华男科学，2003，9（5）：341-343.

Effects of Modified Jinkui Shenqi pill on the Expression of Benign Prostatic Hyperplasia Rats prostate's VEGF，IGF-1

Zhang Xikui1Lu Zhiquan2W u Dong2
（The Second A ffiliated Hospital，Fujian uniuersity of traditional Chinesemedicine，Fuzhou，350004，China）

ObjectiveTo study the therapeutic efficacy of Modified Jinkui Shenqi piu on the expression of VEGF，IGF-1 in prostate of benign prostate hyperplasia（BPH）rat model.MethodsRats were removal both of didymus and injected testosterone propionate to make model of benign prostatic hyperplasia rat.Use the method of immunohistochemistry to detect the expression of vascular endothelial growth factor VEGF，detect the level of insulin-like growth factor-one（IGF-1）mRNA in hyperplasia prostate tissue by RT-PCR.ResultsModified Jinkui Shenqi pill middle dose group could significantly reduce the levels of VEGF and IGF-1 mRNA in hyperplasia prostate tissue.ConclusionModified Jinkui Shenqi pill restrain benign prostatic hyperplasia may be related with regulate the expression of growth factors.

Jinkui Shenqi pill；Benign prostatic hyperplasia；VEGF；IGF-1

10.3969／j.issn.1672-2779.2014.04.090

：1672-2779（2014）-04-0142-03

苏 玲 本文校对：卢志铨

2013-11-08）

福建省自然科学基金计划项目［3201-803110024］