MECP2基因大片段缺失致Rett综合征表型分析

唐利芳 肖冰 徐燕 季星 蒋雯婷 刘晓青 陶炯

MECP2基因大片段缺失致Rett综合征表型分析

唐利芳*肖冰*徐燕*季星*蒋雯婷*刘晓青*陶炯△

目的研究Rett综合征（Rett syndrome,RTT）致病基因甲基化CpG结合蛋白2（Methyl-CpG-binding protein 2,MECP2）大片段缺失突变的3例患儿表型特征。方法对于编码区未检出致病突变而临床表现疑为RTT的7例患儿采用定量PCR技术检测MECP2基因有无缺失突变，随后依据现行修订诊断标准进行随访，明确患儿患病类型。结果 1例因不满足诊断标准被排除。3例检出大片段缺失突变，其中2例典型RTT，1例非典型RTT；余3例未检出片段缺失。结论MECP2大片段缺失突变为RTT常见致病原因且定量PCR对于常规突变筛查方法未检出MECP2突变的患儿是一种简单快速的诊断方法。

Rett综合征 定量PCR大片段缺失

Rett综合征（Rett syndrome,RTT）是一种主要累及女性的X连锁神经系统发育疾病，发病率为1/10 000-1/15000[1]，临床表现为出生后6～18个月出现精神发育停滞或倒退、丧失已获得的技能，如语言、手的功用等，出现手的刻板动作，可伴有智力低下、孤独症样行为、癫痫、共济失调等。95%～97%的典型RTT及50%～70%的非典型RTT可检出甲基化CpG结合蛋白2（methyl-CpG-bingding protein 2,MECP2）基因的致病突变[2-3]。Scala等[4]对77例测序突变阴性的患儿检测到16例大片段缺失突变，其中15例出现在典型RTT患儿中，提示缺失突变是典型RTT的一种常见突变类型。因常规测序方法易造成大片段缺失突变患儿漏检，本试验运用定量PCR技术对疑似RTT的7例患儿行缺失突变筛查并检验该方法在临床诊断中的可行性。

1 对象与方法

1.1 研究对象2011～2012年于新华医院遗传咨询门诊就诊，临床表现怀疑为RTT的7例女性患儿，其年龄2岁～8岁（中位年龄5岁）。经染色体核型分析及MECP2基因常规测序检测未发现异常，依据2010年最新修订诊断标准[5]随访患儿以进一步确认是否患有该疾病及患病类型。

1.2 荧光定量PCR 应用SYBR荧光定量PCR检测MECP2拷贝数。引物由上海生工合成，5’-3’序列为：Exon2：上游ACAGACTCACCAGTTCCTGCTT，下游 GCCCTAACATCCCAGCTACCAT;Intron2-1：上游ATATCCCTGTTGTTGAGCGACT，下游CCCTGTTGACCTCTCTGATGG;Intron2-2：上游 CAACTCCAACTCCTGCTCCT，下游 AGTGGCAAGAGAGGTGATCC;Exon3：上游 TCAGAAGACCAGGACCTCCAG，下游 CTTCCGTGTCCAGCCTTCAG;Exon4：上游CCAAGGAGCCAGCTAAGACT，下游 TTGTCAGAGCCCTACCCATAAG;3’UTR：上游 GGAGTCCACTGGGGTGGCCTGACT，下游 CTCCTGGAGGGGACCCCTTGGACT;IRAK1：上游 ATCCTCAGCCTCCACCTTCCT，下 游 CCTCCTTGTCTCGAATCTTCCCT;HAS：上 游 AGCTATCCGTGGTCCTGAAC，下游 TTCTCAGAAAGTGTGCATATATCTG。分别以15例正常女性等量DNA混合样本及13例正常男性等量DNA混合样本为参照样本，人血清白蛋白基因（Serum albumin,HSA）为内参基因，通过引物浓度调节，使内参和MECP2基因的扩增效率保持基本一致。参照SYBR®Premix Ex TaqTM(TaKaRa Biotechnology，大连)配制反应体系，置Applied Biosystems 7500荧光定量仪，所有样本均设3复管检测，复管间标准差大于0.2时重新检测。

表1 7例患儿RQ值

1.3 数据处理 SDS software version 1.4(Applied Biosystems,美国)分析数据，采用 2-ΔΔCT方法计算MECP2相对基因拷贝数(relative quantity,RQ)。

2 结果

2.1 定量PCR结果 溶解曲线分析无非特异性扩增，RQ结果，见表1。

2.2 诊断结果 3例患儿临床表型见表2。病例1和3因满足4个主要标准诊断为典型RTT,病例2满足3条主要标准，7条诊断标准诊断为非典型RTT，病例4、5为非典型RTT,病例6为典型RTT,病例7经反复核实不满足RTT特有的病程规律被排除。

2.3 病例资料 病例1：女，5岁，患儿系足月剖宫产，出生时无窒息缺氧史，头围34cm，3个月会抬头，6个月独坐，14个月扶走，迈步时宽步态，协调性差，2岁时不再走动。1岁时无明显诱因出现双手抓握样刻板动作且逐渐加重。13个月时会讲简单的词语，15个月时失语，且听不懂简单指令，大小便不示意，表情淡漠，偶有眼神对视。18月时出现发作性屏气，2岁时有阵发性哈气样呼吸。4岁时出现抽搐，服用抗癫痫药（具体不详）后控制良好。现患儿仍无法行走，不会说话，清醒时有磨牙，不时有自顾自发笑，睡眠时大笑，疼痛反应消失，肌张力稍低下，下肢少许色素沉着，萎缩，肌电图示神经传导速度轻度异常。头颅MRI示双侧侧脑室增大，透明隔间腔形成。脑电图有尖波，尖慢波阵发。据此患儿表现诊断为典型RTT。病例2：女，5岁9个月，足月剖宫产，否认孕期及分娩期异常，否认神经系统疾病家族史，出生时头围34 cm，3个月抬头，7个月会坐，1岁时走路稍不稳，但无姿势异常，协调能力尚可，会叫“爸爸妈妈”，会简单表达一些词句，能够主动抓取玩具，18月时出现无目的的绞手样刻板动作，不会抓握汤匙，行走能力丧失，只喜爬，主动言语渐减少至消失，且与父母无眼神交流，脾气不易控制，焦虑时常换气过度，头颅CT检查未发现异常，现患儿已不会讲话，不会走路，睡眠时易惊醒，尖叫，对疼痛反应不敏感，脊柱有轻微侧凸，肌张力稍低下，依据标准诊断为非典型RTT。病例3：女，3岁，患儿足月顺产，无窒息缺氧史，粗大运动，精细运动及语言发育在1.5岁前与同龄儿相比无明显异常，但其后出现快速倒退现象，走路不稳，左右摇摆，平衡感差，协调能力不如前，下肢肌张力低下，久站不能，现患儿完全丧失行走能力，但仍会叫“爸爸妈妈”，会表达一些简单无意义的词语，喜欢含手指，清醒时有叹气式呼吸，磨牙，流涎现象，手脚冰凉，睡眠时伴姿势异常，对玩具没有兴趣，疼痛反应不敏感，但无脊柱侧凸及抽搐。据临床表现诊断为典型RTT。

表2 3例患儿临床表型

3 讨论

国际RTT临床协会发布2010年RTT修订诊断标准，在对2002年诊断标准做了必要的修改与简化后更易临床医生诊断，Percy等[6]大规模分析819例患者的病史验证了修订标准的正确性。其中强调了明显倒退史的重要性，不详时应慎重考虑或定期随访评估。如病例7据家长所述：10个月时不会坐，不会爬楼梯，14个月时仍不会走，不会说话，2岁9个月时患儿表现有好转，可行走，会叫“爸爸妈妈”，而在持续3个月后言语能力再次丧失且伴有走路不稳，否认脑部疾病史及其他疾病家族史。因该患儿有一短暂而明显的症状改善期，与RTT强调的病情进展分期不同，虽满足2条主要标准和5条支持标准，仍需排除。MECP2为RTT主要致病基因，但仍有符合RTT诊断标准的3%～5%的患者未检测到该基因突变，如本实验中的3例患儿，其可能与另一致病基因细胞周期蛋白依赖性激酶样5(cyclin-dependent kinase-like 5，CDKL5)突变有关[7]。而无RTT临床表现的患者可检测到MECP2突变，如孤独症，Angleman综合征，智力低下等，表明RTT诊断仍依据临床表现，MECP2基因检测结果辅助临床诊断。

目前检测MECP2缺失突变的定量方法有定量PCR，MLPA，变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)，Southern blot。DHPLC需行多重PCR，因引物浓度较敏感而易影响结果现已很少使用，Southern blot因操作步骤繁琐，花费时间长，所需DNA量大，低通量等限制了在临床的推广应用，现广泛应用的成熟技术有定量PCR和MLPA,前者因经济成本低，检测时间短，结果可靠，在检测MECP2相对简单的基因结构和高频的缺失突变热点时该方法具有一定的优势。Ariani等[8]运用荧光标记的TaqMan探针行多重PCR反应详细论述了该方法的敏感性与准确性并检测出1例缺失与1例重复，提议其可作为补充DHPLC的一种简单可靠的常规筛查方法，Laccone等[9]采用SYBRGreen定量PCR在170例患儿中（140例疑似RTT和30例典型RTT）检出15例大片段缺失突变，本实验使用同样的方法在6例患儿中检测到3例缺失突变，占我科室确诊为RTT患者12%(3/25)的比例，其与大规模统计数据测得的总缺失检测率11.9%相符，表明定量PCR因在一定程度上降低了缺失突变的漏检率而应用于临床检测的必要性。

Archer等[10]采用定量PCR及MLPA技术在110例MECP2突变筛查阴性的患儿检测到37.8%的典型RTT和7.5%的非典型RTT有单个，多个或全部外显子缺失，其中大于80%的缺失包含外显子3和/或4，4例包含IRAK1基因。 Zhang等[11]在对我国365例RTT患者中检测出6.7%的大片段缺失，其中95.2%为外显子3和/或4缺失，外显子1缺失1例，19例包含外显子4的缺失倾向区（deletion prone region,DPR），本实验3例均有外显子3，4缺失，且均包含DPR，1例携有IRAK1基因片段缺失，表明MECP2基因内存在断裂热点。Laccone等[9]认为外显子4的DPR与内含子2中高达27.8%的Alu重复序列与稳定性相关，Todorov等[12]认为此区域内的回文结构为易突变结构域可引起重复突变和复杂重排，但具体作用机制仍不清楚。

MECP2蛋白作为一种转录调节因子可促进神经元成熟和突触形成，研究发现截断蛋白在体内降解速度可能较快致功能丧失而影响患者表型[13]。在基因型与表型关系的研究中，因评分标准不同，样本量差异，年龄因素等影响，结果有时不完全一致，有学者认为大片段缺失突变较错义突变，C-末端截短突变总体严重程度较高[14-16]。在缺失范围这一影响因素中，Scala等[4]认为外显子1和2缺失与3或/和4缺失，有无IRAK1缺失严重程度评分均无无统计学意义，而Hardwick[17]等认为包含有IRAK1缺失的6例患儿严重程度明显高于无缺失的6例患儿。本实验病例2缺失范围最广，且累及IRAK1，但患儿临床表现相对较轻，这可能与下游靶基因脑源性神经因子基因(brain derived neurotrophic factor,BDNF)的多态性相关[18]。本实验因研究样本过少，无法统计分析，因而不能明确基因型与表型间的关系。综上所述，MECP2大片段缺失为RTT的一种常见致病突变，运用定量PCR这一简单，快速的基因诊断方法在一定程度上提高了此突变类型的检出率从而为临床确诊RTT提供了基因水平的诊断依据。

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R749.9

A

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.04.010

*上海交通大学医学院附属新华医院上海儿科医学研究所遗传室（上海 200092）

△ 上海交通大学医学院附属中国福利会国际和平妇幼保健院产前诊断室

（E-mail:taojiong＠hotmail.com）

2013-04-14）

（责任编辑:李立）

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