白茅根多糖抗氧化活性及抑制α-葡萄糖苷酶活性研究

李容，梁榕珊，覃涛，黄锁义

（右江民族医学院，广西百色533000）

天然多糖是一类结构组成复杂的高分子化合物。研究发现，天然多糖具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、降血脂、免疫调节、抗病毒和抗辐射等多样生物活性[1]，且对人体毒副作用小，在食品、保健品、医药等领域有广泛的用途。目前对天然多糖结构和生物活性研究已成为国际研究的热点。白茅根（Imperata Cylindrica），又名茅草根、地节根、甜草根等，为禾本科植物白茅Imperata cylindrica Beauv.var.major（Nees）C.E.Hubb.的干燥根茎[2]，具有凉血止血、清热利尿、清热生津、保肝等功效[3]。白茅根主要有三萜类、黄酮及色原酮类、木质素类、糖类、有机酸类等多种化学成分，其中糖类是其主要的化学成分，含量占总提取物的80%以上[4]。目前，对白茅根多糖的研究基本集中在提取工艺和结构分析方面，而多糖的药理活性的相关研究较少。本实验对白茅根多糖的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性进行了研究，为多糖的开发利用、拓宽其应用途径奠定理论参考。

1 仪器与材料

1.1 材料

白茅根（Imperata Cylindrica）产地广西贵港市，购于百色市神康医药公司，经右江民族医学院民族医学教研室覃道光副教授鉴定为禾本科植物白茅（Imperata cylindrica Beauv.var.major（Nees）C.E.Hubb.）的干燥根茎，低温干燥至恒重后，粉碎过筛备用。

1.2 试剂

2，2′-连氨-（3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸）二氨盐（ABTS）：上海金穗生物科技公司；抗坏血酸（VC）：上海国药化学试剂公司；α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）：sigma 公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）：上海金穗生物科技公司；谷胱甘肽：上海国药化学试剂公司；阿卡波糖：德国拜耳公司（批号117358），其余试剂均为分析纯。

1.3 仪器

FZ102 植物粉碎机：上海锐丰仪器仪表有限公司；MK3 酶标仪：塞默飞世尔科技有限公司；FD-1A-50 真空冷冻干燥机：上海比朗仪器有限公司；LRH-150 恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；3-18K 离心机：SIGMA 公司；RE-52AA 型旋转蒸发仪：上海安亭实验仪器有限公司；DHG-9070A 型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；CPA64 型电子天平：北京塞多利斯仪器公司；HHS-21-4 电热式恒温水浴锅：江苏金坛宏凯仪器厂；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司。

2 方法

2.1 白茅根多糖的制备

按文献[5]的方法稍加改进提取分离白茅根多糖。取干燥的白茅根，粉碎过60 目筛，取500 g 过筛粉末，加入1 L 95%乙醇，在常温下静置24 h，再在50 ℃水浴中回流提取3 h，过滤，滤渣晾干，加入2 L 水90 ℃水浴中提取3 h，过滤收集滤液，滤渣再重复加水提取1 次，合并2 次滤液，减压浓缩至200 mL，离心除去杂质，在清液中加入95%乙醇进行醇沉，冰箱中静置过夜，过滤，真空冷冻干燥得白茅根粗多糖。将得到的白茅根粗多糖溶解，加入Sevag 试剂（氯仿∶正丁醇=4 ∶1）脱蛋白，反复脱蛋白多次，直至无变性蛋白，收集水相，加入95%乙醇进行醇沉，冰箱中静置过夜，过滤，冷冻干燥得精制多糖7.3 g。

2.2 白茅根抗氧化活性研究

2.2.1 总还原能力

[6-7]进行测定。取1 mL 多糖溶液，加入0.2 mol/L pH 6.6 的磷酸盐缓冲溶液2 mL，1 %铁氰化钾2 mL，混合均匀后置50 ℃水浴中恒温20 min，水浴后用冰水迅速冷却，加入10%三氯乙酸2.5 mL，3 000 r/min 下离心10 min，取2 mL 上清液于试管，加入2 mL 蒸馏水，0.5 mL 0.1%三氯化铁，摇匀后静置10 min，测700 nm 处的吸光度。以VC为阳性对照，按相同的方法进行测定，实验重复3 次，取平均值。

2.2.2 清除ABTS 自由基作用

参考霍丽妮[8]等方法进行测定。精密称取ABTS 40 mg，用蒸馏水配制成浓度为7 mmol/L 的溶液，取5 mL ABTS 溶液与5 mL 浓度为2.45 mmol/L 的K2S2O8溶液混合，室温下避光放置16 h，用无水乙醇稀释混合液，使其吸光度在734 nm 处为0.700 左右，即为ABTS+·储备液。量取2 mL 多糖溶液与4 mL ABTS+·储备液，混合避光静置6 min，测吸光度值。以VC作为阳性对照，实验重复3 次，取平均值，按下式计算清除率。式中：A0为不加多糖溶液的吸光度，A1为加入多糖溶液后的吸光度，A2为不加ABTS+·的吸光度，不加的体积均由蒸馏水补足体积。

2.2.3 清除羟基自由基作用

采用水杨酸法进行测定[9]。在试管中分别加入8 mmol/L FeSO41 mL、5 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液2 mL和不同浓度的白茅根多糖溶液2 mL，最后加入0.3%H2O21 mL 启动反应，在室温下反应0.5 h，测510 nm 处吸光度。以VC作为阳性对照，实验重复3 次，取平均值，按下式计算清除率。式中：A0为不加多糖溶液的吸光度，A1为加入多糖溶液后的吸光度，A2为不加H2O2的吸光度，不加的体积均由蒸馏水补足体积。

2.3 白茅根多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性

对Tiabou[10]测定α-葡萄糖苷酶活性的方法进行改进，实验分空白组、空白背景组、抑制剂组、抑制剂背景组，抑制剂为多糖和阳性对照阿卡波糖。在96 孔板中加入50 mmol/L pH 6.8 的磷酸盐缓冲溶液50 μL，5 mmol/L 还原谷胱甘肽2.5 μL，3.3×10-5kat/L α-葡萄糖苷酶2.5 μL，分别加入不同浓度的抑制剂10 μL，混匀后在37 ℃的恒温箱中恒温10 min，加入20 mmol/L pNPG 5 μL，再置37 ℃的恒温箱中恒温10 min，加入0.1 mol/L Na2CO350 μL 终止反应，用酶标仪测定在405 nm 处的吸光度值。空白组不加抑制剂，空白背景组不加pNPG 和抑制剂，抑制剂背景组不加pNPG，均由蒸馏水补足体积，其他操作同抑制剂组。抑制剂对α-葡萄糖苷酶活性抑制率按下式计算，式中：A1为空白组吸光度值，A2为空白背景组吸光度值，A3为抑制剂组吸光度值，A4为抑制剂背景组吸光度值。

3 结果

3.1 总还原能力

白茅根多糖和阳性对照物VC的总还原能力如图1 所示。

一般来说，吸光度值越大，表明物质的还原能力越强，即其抗氧化能力也越强。从图1 可知，在实验浓度范围内，VC的还原能力随其浓度的增大而增大，当浓度为0.5 mg/mL 时其吸光度值已大于1.400，浓度超过0.5 mg/mL 后吸光度值增大的幅度较小。白茅根多糖的还原能力与其浓度呈明显的直线相关性，其线性相关系数r=0.997 6。白茅根多糖总还原能力明显低于VC，但任有一定的还原能力。

图1 白茅根多糖的还原能力Fig.1 Reducing power of polysaccharide from Imperata Cylindrica

3.2 清除ABTS 自由基结果

白茅根多糖和阳性对照物VC清除ABTS 自由基结果如图2 所示。

图2 白茅根多糖清除ABTS 自由基能力Fig.2 Scavenging ablility of polysaccharide from Imperata Cylindrica on ABTS+·

当多糖和VC浓度为0.05 mg/mL 时，其清除率分别为95.3%、80.6%。在实验浓度范围内，VC和多糖对ABTS 自由基的清除率均与浓度呈直线相关性，VC和多糖的线性相关方程分别为Y=1783X+9.59、Y=1525X+4.53，线性相关系数分别为0.986 0、0.997 1。用半抑制浓度IC50来衡量其清除能力的大小，IC50越小，其清除能力越强。VC和多糖的IC50分别为0.023、0.029 8 mg/mL，显示出较好的清除效果。

3.3 清除羟基自由基结果

白茅根多糖对清除羟基自由基实验结果如图3所示。

白茅根多糖对羟基自由基的清除率随浓度的增大而增大，当白茅根多糖浓度大于1 mg/mL 时，清除率大于50%。根据白茅根多糖的浓度（X）与清除率（Y），拟合得到回归方程Y=34.146X+12.132，r=0.991 6，IC50为1.1 mg/mL。与相同浓度的阳性对照品Vc 相比，其清除羟基自由基能力低于VC。

图3 白茅根多糖清除羟基自由基作用Fig.3 Scavenging ablility of polysaccharide from Imperata Cylindrica on·OH

3.4 白茅根多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性

α-葡萄糖苷酶抑制剂的显著特点是能有效地阻止糖尿病患者餐后血糖升高，使血糖维持在一定水平，减少血糖对胰腺的刺激，能有效预防并改善糖尿病并发症。以α-葡萄糖苷酶作为靶点，通过体外活性抑制试验从中草药中筛选具有治疗糖尿病的有效成分已成为糖尿病治疗药物研究的热点之一[11]。白茅根多糖对α-葡萄糖苷酶抑制活性结构如图4 所示。

图4 白茅根多糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.4 The α-glucosidase inhibitory activities of polysaccharide from Imperata Cylindrica

白茅根多糖的抑制率较低，增大多糖浓度，抑制率增大的幅度并不大，甚至还有降低的趋势，实验中尝试继续增大多糖的质量浓度，仍未出现明显的抑制率增强。提示白茅根多糖并不能通过抑制α-葡萄糖苷酶活性来实现降血糖功效。

4 讨论

白茅根是传统的药食同源中药材，具有极大的药用与食用价值。白茅根多糖是其重要的有效成分之一，研究表明白茅根多糖具有明显提高小鼠耐缺氧能力作用[12]。因此，探明白茅根多糖的药理活性，可拓宽其应用。

本实验用总还原能力、清除ABTS 自由基、羟基自由基3 项指标来评价白茅根多糖的体外抗氧化活性，并与抗氧化剂VC进行比较。结果表明，白茅根多糖总还原能力低于VC，对ABTS 自由基的清除作用较强，接近VC，IC50为0.029 8 mg/mL，对羟基自由基也有一定的清除作用，IC50为1.1 mg/mL。本实验评价白茅根多糖的抗氧化活性指标并不全面，在后续研究中应更加全面的探明其抗氧化活性。抑制α-葡萄糖苷酶活性实验表明，白茅根多糖对α-葡萄糖苷酶并无明显的抑制作用，提示其并不能通过抑制α-葡萄糖苷酶来实现降糖。

参考文献：

[1] 刘姚,欧阳克蕙,葛霞,等.植物多糖生物活性研究进展[J].江苏农业科学,2013,41(1):1-3

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社,2005:70

[3] 李水福.浅谈畲药白茅根的鉴别及开发利用[J].中国民族医药杂志,2010(8):52-53

[4] 刘荣华,付丽娜,陈兰英,等.白茅根化学成分与药理研究进展[J].江西中医学院学报,2010,22(4):80-83

[5] 邹一可,张明月,王彩云,等.白茅根多糖IC1 的分离及其相对分子质量和单糖组成的测定[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(2):80-82

[6] 尚晓娅,张媛,白艳宁,等.绞股蓝多糖体外抗氧化活性研究[J].天然产物研究与开发,2013,25(4):450-454

[7] Lin C L,Wanf C C,Chang S C,et al.Antioxidative activity of polysaccharide fractions isolated from Lycium barbarum Linnaeus[J]. Int J Biol Macromol,2009,45(2):146-151

[8] 霍丽妮,廖艳芳,陈睿,等.狐狸尾不同极性溶剂提取物体外抗氧化活性研究[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(23):155-158

[9] 梁鹏,甄润英.辣木茎叶中水溶性多糖的提取及抗氧化活性的研究[J].食品研究与开发,2013,34(14):25-28

[10] Tiabou T A,Nahar K S,Fuendjiep V, et al.Alpha-Glucosidase inhibitors from Millettia conraui[J].Chemical and pharmaceutical Bulletin,2007,55(9):1402-1403

[11] 潘艺井,蒋文雯,聂昌平,等.7 种贵州民族药材提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用[J].中华中医药杂志,2012,27(2):385-388

[12] 孙立彦,刘振亮,孙金霞,等.白茅根多糖对小鼠耐缺氧作用的影响[J].中国医院药学杂志,2008,28(2):96-99