草鱼鱼鳞胶原蛋白肽的制备及分析

鉏晓艳，熊光权，李新，耿胜荣，于巍，江洪有，廖涛

（湖北省农业科技创新中心/湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所/湖北省农产品辐照工程技术中心，湖北武汉430064）

我国是世界上最大的淡水鱼养殖国，随着淡水鱼类加工业的快速发展，加工过程中产生大量的废弃物，如鱼鳞。通常鱼鳞加工利用程度很低，绝大部分被直接丢弃，不仅严重污染了环境，而且造成了资源的浪费。其实，鱼鳞富含胶原蛋白，从中提取胶原蛋白肽不仅能够充分利用资源，提高鱼类加工的附加值，而且可以减少环境污染，对促进鱼类加工业的良性发展具有重要意义。

胶原蛋白，是结缔组织中极其重要的一种结构蛋白，是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质，约占体内蛋白质总量的25%～30%[1]。胶原蛋白分子量很大需经过生物技术降解至分子量到500 D～2500D 范围，人体才能有效吸收[2]。目前，国内鱼鳞胶原蛋白肽的开发尚处于起步阶段，相关研究主要集中在胶原蛋白肽的提取工艺和提取方法等方面。胶原蛋白肽的提取和降解，依据提取介质的不同可以分为3 种：即热水提取[3-4]、酸法提取[5]、碱法提取[6]等。此外，还有酸、碱结合热水提取等。上述方法普遍存在提取周期长，提取率不高，以及酸、碱等废液排放对环境造成影响等问题。因此，本研究旨在利用淡水鱼副产品-鱼鳞，通过优化酶解提取过程，减少酸碱使用量，制备小分子胶原蛋白肽产品，并获得其相关性状指标。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

草鱼鱼鳞由武汉市武商量贩提供。

1.1.2 试剂

木瓜蛋白酶（sigma 分装，酶活0.1 kat/g），蛋白质标样（分子量为10 ku～100 ku）购自德国Thermo Scientific公司，其他试剂为国药分析纯。

1.1.3 主要仪器与设备

微量移液器：德国eppendorf；DYCZ-24DN 型双垂直电泳槽、DYY-6C 稳压稳流电源：北京六一；氨基酸自动分析仪：日立L-8800；2695 型凝胶渗透色谱仪：美国waters。

1.2 方法

1.2.1 鱼鳞胶原蛋白肽的提取工艺

草鱼鱼鳞→清洗阴干→脱杂蛋白→脱钙→酶解→脱腥脱苦→分级纳滤→冷冻干燥→胶原蛋白肽干粉

1.2.2 草鱼鱼鳞的脱钙与羟脯氨酸溶出率的测定

准确称取1.0 g 脱杂清洗烘干的鱼鳞于250 mL 锥形瓶中，平行3 份，以1 ∶60（g/mL）料液比分别加入0.6 mol/L 醋酸溶液、0.6 mol/L 盐酸溶液、0.6 mol/L 柠檬酸溶液，放在摇床上25 ℃恒温脱钙24 h，摇床转速150 r/min。脱钙充分后，参考GB-T 5009.92-2003《食品中钙的测定》[8]的方法测定溶液中的钙含量，并按如下公式计算脱钙率：法进行计算。脱钙充分后，羟脯氨酸按照GB/T 9695.23-2008《肉与肉制品羟脯氨酸含量测定》[9]中的方法进行测定，得到溶液中溶出的羟脯氨酸含量（μg/mL）。

1.2.3 草鱼鱼鳞酶解条件的优化

为了获得酶解最佳条件，我们设计了5 因素4 水平的正交试验。分别为酶解温度（℃）50、55、60、65；酶添加量（%，质量分数）2、4、6、8；酶解时间（h）1、2、3、4；pH5、5.5、6、6.5；料液比1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40。取2 g鱼鳞，按表1 进行处理。得到的酶解液根据甲醛滴定法[10]进行水解度的测定。

1.2.4 草鱼鱼鳞胶原蛋白肽的分子量测定

我们采用Tricine-SDS-PAGE 凝胶电泳法[11-12]，对得到的胶原蛋白肽的分子量范围进行测定。采用垂直板式电泳槽，12%的分离胶与4%浓缩胶，标准蛋白质加样量为10 μL，待测样加样量为20 μL。先在60 mV的电压下电泳，待样品进入分离胶后，再将电压调整至100 mV 左右，当溴酚兰指示带接近胶底1 cm 时，停止电泳。小心将凝胶取下，用5%戊二醛固定1 h，置于染色容器中染色5 h～6 h，再用脱色液脱色1 h。

为进一步明确其分子量，我们用凝胶渗透色谱法[13]具体测定了获得的胶原蛋白肽的分子量。配制1 000 mL的0.1 mol/L 磷酸氢二钠溶液，其中含8 g 叠氮化钠，用磷酸二氢钠调节pH 至8.0，取500 mL 作为储备液。另取500 mL 储备液稀释至2 000 mL 作为淋洗液。进样量为100 μL，溶剂为水-0.2M 硝酸钠，淋洗液流速为0.6 mL/min。标样为聚乙烯乙二醇，柱子温度40 ℃，检测器温度40 ℃。

1.2.5 草鱼鱼鳞胶原蛋白肽氨基酸测定

根据GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》[14]方法进行鱼鳞胶原蛋白肽的前处理，自动氨基酸分析仪测定其水解氨基酸种类及含量。

2 结果与分析

2.1 不同试剂对鱼鳞脱钙效果及羟脯氨酸溶出率的影响

不同试剂对鱼鳞脱钙效果及羟脯氨酸溶出率的影响见图1。

图1 不同试剂处理鱼鳞的脱钙率及羟脯氨酸溶出率Fig.1 Effect of different reagents on decalcification rate and hydroxyproline dissolution rate of fish scales

由图1 结果可知，3 种酸比较，盐酸脱钙效果最好，柠檬酸次之，醋酸再次之。但是此结果与EDTA 二钠的脱钙结果相比，没有优势。醋酸和柠檬酸的脱钙效果较差，不适合工业生产。另一方发面，羟脯氨酸是鱼鳞胶原蛋白肽中的特征氨基酸，它在上清液中的浓度表征胶原蛋白的溶出及损失。图1 结果显示，柠檬酸处理鱼鳞后，上清液中羟脯氨酸浓度最高，即胶原蛋白损失最多。醋酸处理的鱼鳞虽然溶液中羟脯氨酸浓度较低，胶原蛋白损失较少，但其脱钙效果差，所以不适用于生产。就实验结果而言，使用EDTA 二钠处理鱼鳞，不但脱钙效果最好，且上清液种羟脯氨酸浓度较低，说明处理过程中胶原蛋白损失较少，是较好的脱钙试剂。

2.2 草鱼鱼鳞酶解条件的优化（5 因素4 水平正交试验）

草鱼鱼鳞酶解条件优化结果见表1。

表1 酶解正交试验L16（54）及结果Table 1 Orthogonal experiment L16（54）of enzymolysis and results

根据表1 水解度和K 值结果，酶解温度60 ℃、酶添加量8%、酶解时间2 h、pH 5.0、料液比1 ∶30（g/mL）时，水解度最高。R 值结果显示，酶解温度、酶解时间、料液比是影响酶解效果的主要因素，酶添加量和pH为次要因素。此外，对水解度较高的三组数据进行了t-test 成对检验，结果表明，实验15 的处理结果与优于实验10 的处理结果，差异显著（p＜0.05）。实验12 的处理结果虽然平均值较高，但与实验15 和实验10 的结果相比，无显著性差异，可能由于其本身结果偏差较大的缘故。

2.3 草鱼鱼鳞胶原蛋白肽分子量的测定

胶原蛋白肽分子量结果见图2～图3 和表2。

图2 正交试验中实验9-15 所得酶解液的Tricine-SDS-Page电泳结果Fig.2 Tricine-SDS-Page electrophoresis results of enzymatic hydrolyzates of test 9-15 in Orthogonal experiment L16（54）

图3 凝胶渗透色谱的测定结果Fig.3 Results from Gel permeation chromatography measurement

表2 草鱼鱼鳞胶原蛋白肽的分子量结果Table 2 Molecular weight of fish scale collagen peptide from Grass carp

我们对正交实验（表1）中所得到的胶原蛋白肽进行了Tricine-SDS-Page 电泳，其中实验9-16 的电泳结果见图2，结果表明，有基团较小的蛋白质条带出现（图2 箭头处），其分子量远低于10 ku。为了进一步明确这个蛋白质基团的分子量，我们用凝胶渗透色谱进行具了体测定，表2 结果显示，酶解后粉末中主要是这种小分子蛋白，分散度小、分子量均一，其峰值分子量和数匀分子量均低于500 u。图3（横坐标为出峰时间，纵坐标为电信号值表征出峰强度）结果显示，胶原蛋白肽出峰良好，峰形对称，无拖尾和鼓包现象，主要分子量集中在454 u。

2.4 草鱼鱼鳞胶原蛋白肽的氨基酸分析

为了弄清鱼鳞胶原蛋白肽的氨基酸组成，我们进行了水解氨基酸分析，结果见表3。

表3 草鱼鱼鳞及其胶原蛋白肽的氨基酸含量及比例Table 3 Amino acid content and proportion of Grass carp fish scale and its collagen peptide

表3 显示，鱼鳞胶原蛋白肽中甘氨酸、丙氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸的含量较高。除了酪氨酸和胱氨酸的含量较低外，其余16 中氨基酸均超过胶原蛋白肽总重的1%，共占氨基酸含量的99.07%。草鱼鱼鳞中氨基酸的含量占鱼鳞总重的31.19%，其中甘氨酸、羟脯氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸，精氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、亮氨酸的含量较高，均超过鱼鳞总重的1 %，占鱼鳞氨基酸总含量的83.44%。

3 讨论与结论

由于酸碱脱钙处理会造成环境负担，因此本研究采用EDTA 二钠处理鱼鳞。EDTA 二钠是优良的络合剂（螯合剂），可以有效螯合多种金属离子（如，钙、镁、铁、铅、铜、锰等）。本实验结果表明相对于酸处理来说，EDTA 二钠不但能高效脱钙还能减少鱼鳞胶原蛋白肽的特征氨基酸-羟脯氨酸的溶出率，是鱼鳞脱钙前处理的较理想试剂。

在酶种类的选择上，本研究前期结果显示，胃蛋白酶由于作用pH 较低，导致制备的胶原蛋白肽酸苦味重，后处理困难。因此本研究以木瓜蛋白酶作为实验用酶，优化酶解条件，将人体难以消化吸收的鱼鳞胶原蛋白定向剪切成小分子活性肽。结果表明，最佳酶解条件为：酶解温度60 ℃、酶添加量8%、酶解时间2 h、pH 5.0、料液比1 ∶30（g/mL）。获得的胶原蛋白肽分子量均一，分散度小，平均分子量在500 u 左右。鱼鳞经木瓜蛋白酶酶解后，氨基酸绝对含量上升，但组成变化不大，其中主要含有甘氨酸、丙氨酸、羟脯氨酸等。

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