3-甲基腺嘌呤诱发HeLa细胞自噬及抑制辐照细胞自噬的双重作用

杨艳丽 刘 玲 王 豫 刘晓丹 周平坤

自噬是指细胞将一些聚集或错误折叠蛋白、损伤的细胞器等胞质成分通过包裹并最终运送至溶酶体降解的过程，可促进细胞代谢的原料的循环再利用［1］。目前认为，自噬的主要功能之一是真核细胞在营养缺乏、生长因子撤除、能量匮乏或受到应激性的死亡威胁时，使细胞获得对抗不利的生长环境、维持稳态、实现更新的一种重要的自我保护性反应机制［2］。但是，当细胞受到严重的不可修复的损伤，如大剂量的电离辐射辐照、某些化疗药物的作用，自噬就会转变成为细胞的一种死亡机制。正是由于自噬在决定细胞命运中具有双面性，有关其调控机制的研究受到极大关注。

生长因子刺激信号通过激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt/mTOR信号途径抑制自噬，而Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶复合物(PI3KC3/Vps34)是启动细胞自噬的一个关键调控复合体，PI3KC3/Vps34被激活后会产生磷脂酰肌醇3-磷酸(phosphatidylinositol 3-phosphate，PIP)，PIP则促进其他自噬相关蛋白家族成员(autophagy related protein family，Atg)的募集，启动自噬过程［3，4］。3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)是一种磷脂酰肌醇3激酶抑制剂，因其能抑制参与自噬调节的Ⅲ型PI3K的活性，而被广泛用于自噬研究［6］。笔者前期的实验也证实，3-MA可以抑制饥饿诱导的细胞自噬，并增加细胞的放射敏感度。本研究发现，3-MA单独作用也能诱导细胞自噬和促进细胞凋亡。因此，进一步对3-MA在辐射诱导的细胞自噬及凋亡中的作用进行探讨，将为今后3-MA合理使用以及放射诱发自噬机制的阐述提供新的依据。

材料与方法

1．细胞培养和试剂:人子宫颈癌细胞HeLa为本实验室留存。细胞在含10%胎牛血清(Hyclone公司)的DMEM(Hyclone公司)中，37℃ 5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。3-甲基腺嘌呤(3-MA)购自Sigma公司。

2．细胞照射:利用军事医学科学院放射与辐射医学研究所的60Co放射源γ射线照射，照射剂量率为128．81 cGy/min。

3．CCK-8细胞增殖毒性检测试验分析细胞存活:将预定数量细胞接种于A、B两个96孔板中，A板4Gy γ射线照射，B板不照射。照射组和不照射组分别又分为加3-MA组和不加3-MA组，细胞置于37℃、5%CO2培养箱内培养，分别于不同时间吸干培养液(每个时间设3～5个复孔)，加入含10μl CCK-8(DojinDO公司)的新鲜培养液 100μl，孵育 1h后，450nm波长测量吸光值(OD值)，根据OD值计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(实验组OD值 -空白孔OD值)/(对照组OD值 -空白OD值)×100%。其中实验组为照射和(或)3-MA处理细胞组，对照组为未经任何处理的细胞组，空白组为单纯培养基加上CCK-8试剂。

4．AnnexinⅤ-FITC/PI双标记检测细胞凋亡:将细胞分为照射和不照射两组，每组又分为照射前3h加3-MA和不加3-MA 两个亚组，分别 4Gy 照射后 0、6、24、30、48、72h 后，用0．25%胰酶消化，并用预冷的PBS洗涤细胞2次;以1×106/ml的密度重悬细胞于500μl缓冲液(含Ca2+)中;分别加入5μl annexinⅤ -FITC 和 5μl碘化丙啶(propidiumiodide，PI)，轻轻混匀，室温避光孵育15min，用流式细胞仪检测细胞凋亡。进行3次重复实验取平均值。

6．Western blot法检测蛋白表达:用PBS洗涤各组细胞2次后，使用M-PER蛋白裂解液冰上裂解蛋白30min，12000×g离心15min，收集上清液。采用二喹啉甲酸法(BCA法)测定蛋白浓度后，将蛋白与6×上样缓冲液混匀，100℃煮沸5min，蛋白上样量为20μg，行8%SDS-PAGE分离蛋白，将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂牛奶于室温下封闭1h;分别加入一抗SQSTM1/p62、GAPDH(Santa Cruz公司)，4℃培育过夜后，TBST清洗3次;加入辣根过氧化物酶标记的二抗(北京中杉金桥公司)室温摇晃孵育1h后，TBST清洗3次，显影。

7．GFP-LC3转染及免疫荧光分析:采用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)转染带荧光标记GFP的自噬标记蛋白轻链3(GFP-LC3)的质粒于HeLa细胞;转染后24h 4Gyγ射线照射，不同时间点收集细胞，4%多聚甲醛固定并置于4℃冰箱。将固定好的细胞 PBS洗3次，每次5min。用终浓度0．3%TritonX-100 透膜处理15min，PBS洗3 次每次5min，最后用DAPI染色细胞核20min，再用PBS洗3次每次5min，封片。荧光显微镜观察自噬体的形成，计数自噬体数量，实验重复3次。

8．统计学方法:所有数据均利用SPSS 13．0统计学软件进行，多样本间比较采用方差分析，组间两两比较采用独立样本t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．3-MA的细胞增殖毒性及对γ放射损伤的影响:由于5mmol/L是文献报道中3-MA较常用的的工作浓度，为此笔者设定3-MA作用浓度为5mmol/L，将HeLa细胞分为4组即:60Co γ射线4Gy照射组、3-MA处理组、照射加3-MA组和实验对照组(Control)。分别于照后 3(细胞贴壁后)、6、9、12、48和72h，用CCK-8试剂检测了不同处理后HeLa细胞的增殖和毒性效应(表1)，结果显示各处理组与对照组相比，在12h以内细胞增殖没有明显的影响;3-MA作用24h可发现明显的细胞增殖毒性，单独4Gy照射组与不做任何处理的对照组相比尚无明显变化;在照射后或3-MA作用48h以上时间，各实验组的OD值不但不增加，反而低于24h时间节点值，显示出明显的致死性细胞毒效应，而且5mmol/L 3-MA处理比4Gy照射的致细胞死亡毒性更大;72h则显示复合毒性效应，细胞存活率更是下降到正常细胞的40%左右。

表1 4Gy照射和3-MA单独和复合作用的细胞毒性的时间效应(OD值，±s)

表1 4Gy照射和3-MA单独和复合作用的细胞毒性的时间效应(OD值，±s)

a与相应时间对照组相比，aP＜0．05;与相应时间的4Gy照射组相比，bP＜0．05;相应时间的各组方差分析，cP=0．00

时间(h)处理方式0 3-MA 4Gy 4Gy+3-MA P 93 6 1．27 ±0．02 1．27 ±0．06 1．22 ±0．06 1．22 ±0．02 0．10 9 1．29 ±0．03 1．29 ±0．12 1．24 ±0．06 1．29 ±0．08 0．26 12 1．49 ±0．03 1．48 ±0．08 1．44 ±0．07 1．48 ±0．04 0．61 24 1．86 ±0．04 1．63 ±0．02a，b 1．80 ±0．04 1．73 ±0．02a，b 0．00c 48 1．96 ±0．09 1．14 ±0．11a，b 1．73 ±0．09a 1．13 ±0．05a，b 0．00c 72 1．88 ±0．09 1．00 ±0．10a，b 1．36 ±0．05a 0．91 ±0．02a，b 0．00 3 1．21 ±0．03 1．23 ±0．05 1．21 ±0．03 1．22 ±0．06 0．c

2．3-MA促进受照射细胞凋亡:细胞经4Gy照射或5mmol/L 3-MA单独或联合作用后不同时间，AnnexinⅤ-FITC/PI标记流式细胞术检测细胞凋亡(图1)。与未经过任何处理的对照组相比，加3-MA作用或4Gy照射细胞24h以后，凋亡率显著高于对照组。而且，5mmol/L 3-MA的细胞凋亡效应比4Gy照射更大，并随作用时间延长而增加，作用48h，显示出3-MA与照射的复合效应，说明3-MA大于48h的长时间处理能显著促进受照射细胞的凋亡发生。

图1 AnnexinⅤ-FITC/PI标记流式细胞术检测3-MA对4Gy γ射线诱发细胞凋亡的影响

3．3-MA自身及对γ射线诱导自噬的影响:在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来观察自噬体形成，并计数每个细胞质内的自噬体数目。结果显示:5mmol/L 3-MA单独作用的HeLa细胞，可观察到自噬体的形成，并随着时间的延长显著增多(图2A)，作用后12h，可以明显观察由3-MA单独诱导的自噬体数目比单独4Gy照射更多(图2B);4Gy照射HeLa细胞，在照后6～9h自噬体的形成达到最高峰;意外的是，当γ射线照射前3h加入3-MA作用时，自噬在各个时间点均处于抑制状态。自噬选择性底物SQSTM1/p62蛋白的降解是细胞自噬的标志之一，各组细胞在4Gy或5mmol/L 3-MA单独或联合作用后不同时间点收集细胞，通过Western blot检测SQSTM1/p62的蛋白量变化。3-MA和4Gy照射单独处理的HeLa细胞，SQSTM1/p62蛋白量在3h内是表达增加的。随时间延长逐渐减少(图3)。而细胞在照射前3h加3-MA处理后，SQSTM1/p62表达基本处于同一水平，说明3-MA与辐射联合作用，抑制了SQSTM1/p62蛋白的降解，显示辐射诱导的细胞自噬受到抑制，此结果与图3一致。

讨 论

自噬被认为是除DNA修复和细胞周期检查点反应以外的细胞免受电离辐射DNA损伤致死效应的保护性机制之一［8，9］。也有研究报道，自吞噬如同凋亡一样，是电离辐射所致细胞死亡的通路之一［10］。由此可见，电离辐射作用细胞的自噬机制和生物学后果比较复杂。而在自噬的研究中，3甲基腺嘌呤因被视为自噬关键调节分子Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶的抑制剂，而用于包括辐射在内的多种理化因子和环境因素诱发自噬的研究，在运用中普遍采用5mmol/L的较高作用浓度。本研究发现，3-MA在较高浓度下(如5mmol/L)长时间作用超过24h能显著影响细胞存活率，并比4Gy照射更能促进细胞凋亡，3-MA与辐射同时作用超过一定的时间，则显示出更强的复合毒性。因此3-MA抑制自噬作用的时间和剂量特异性还有待进一步明确。本研究显示辐射可以诱导细胞自噬，但3-MA单独作用于细胞也可以促进自噬，这很可能与3-MA持续抑制Ⅰ型PI3K从而促进自噬有关［11］。实验还发现，3-MA与4Gy照射联合作用的24h内，HeLa细胞自噬和自噬底物SQSTM1/p62蛋白的降解得到了有效的抑制，其机制还有待进一步明确，可能是3-MA诱发自噬后，使细胞对后来的4Gy照射产生了适应性反应，也可能是辐射后，3-MA作为PI3K抑制剂发挥功能，通过抑制Ⅲ类PI3K抑制了细胞自噬。

图2 免疫共聚焦检测5mmol/L 3-MA处理后，照射及未照射细胞自噬体的形成

图3 Western blot检测5mmol/L 3-MA处理后，照射及未照射细胞自吞噬蛋白SQSTM1/p62表达变化

对照之前的细胞存活及凋亡结果，笔者得出结论，3-MA能有效抑制辐射诱导的细胞自噬，也能有效促进正常培养的细胞自噬。长时间作用能促进细胞凋亡，尤其促进辐射后的细胞凋亡。细胞毒性效应浓度下的3-MA诱发自噬和凋亡作用的揭示，为今后工作中3-MA作为自噬抑制剂的合理使用和结果的解释提供了有价值的信息。

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