人参皂苷Rb1激活Nrf2/ARE通路对术后疲劳综合征老年大鼠骨骼肌氧化应激损伤的影响

毛翔宇 庄成乐 陈伟哲 刘 舒 朱 江 吴天添 张昌静 陈必成 余 震

术后疲劳综合征(postoperative fatigue syndrome，POFS)为手术后常见的一种并发症，多发生于腹部大手术，它的产生对患者的术后康复速度和质量的影响很大［1］。老年患者因其特殊的生理代谢状态以及较高的慢性疾病发生率使其抵御有害刺激的能力相对较弱。通过临床观察，笔者发现这类人群腹部大手术后疲劳感甚为突出，术后康复时间增加，质量下降［3］。基于此，减轻老年人POFS，加速术后恢复一直是外科领域研究的突出点。本课题组前期研究表明，人参皂苷Rb1可以通过降低骨骼肌氧化应激损伤并提高抗氧化酶活性及增强骨骼肌能力而产生抗术后疲劳效果，但其具体机制并不为人所知［3］。Nrf2/ARE是至今发现的最重要的一条抗氧化通路，激活该通路可使机体产生相应抗的氧化酶和Ⅱ相药物代谢酶，从而加强细胞清除活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的能力，保持氧化还原平衡，减低氧化损伤。有研究报道，在人多巴胺能细胞中，通过激活Nrf2/ARE，人参皂苷Rb1能降低6-OHDA所致的氧化应激损伤［5］。因此，本研究在前期研究的基础上，欲进一步探究Nrf2/ARE通路在人参皂苷Rb1减轻POFS老年大鼠骨骼肌氧化应激损伤中的具体效应，挖掘人参皂苷Rb1的抗疲劳机制。

材料与方法

1．材料:(1)药物与试剂:人参皂苷Rb1(纯度≥98．0%)(同田生物技术有限公司)，MDA、SOD测试盒(建成生物工程研究所)。RT、SYBR Green试剂盒(TOYOBO公司)，Trizol(life technology公司)，兔抗Nrf-2 GAPDH lamin B1多克隆抗体(Abcam公司)，山羊抗兔 IgG/HRP二抗(Biosharp公司)，兔二步法检测试剂盒和DAB显色试剂盒(中杉金桥有限公司)，其余试剂购于金山试剂有限公司，均为分析纯。(2)动物:SPF级老年雄性SD大鼠，体重650～750g，购自维通利华实验动物有限公司，饲养于温州医科大学外科学实验室至22个月龄。本研究通过温州医科大学伦理委员会审核，全程遵守《实验动物管理条例》。

2．方法:(1)动物分组与模型制备:96只大鼠被随机分为3组，分别为假手术对照组，POFS模型组和人参皂苷Rb1干预组，每组再按时间点分为术后6h，第1、3、7天4小组，共12组。对照组大鼠进腹腔后翻动肠袢后关腹，模型组和干预组大鼠行70%中段小肠切除以制作POFS大鼠模型［7］。(2)给药:干预组大鼠术前3天知道取材当天，以4ml/kg体重比，每日腹腔内注射1次的人参皂苷Rb1(生理盐水稀释至3．75g/L)。对照组和模型组则腹腔内注射相同比例生理盐水。(3)疲劳评估:采用旷场实验［8］。实验装置大小为 150cm×150cm×60cm，内面黑色的木制无盖方箱，底部划为30cm×30cm的方格。实验在安静，微光的房间进行。将大鼠放于中心方格并开始记录其经过的格子数，直立次数、修饰时间、休息时间，整个过程历时3min。(4)标本采集:各组完成旷场实验后，按照3．5ml/kg体重予2%戊巴比妥钠腹部皮下注射，麻醉完成后立即取左下肢腓肠肌若干并于4℃预冷的生理盐水清洗干净，滤纸吸干，分装于液氮中，30min后转至-80℃超低温冰箱保存。(5)指标测定:1)超氧化物歧化酶 (SOD)活性和丙二醛(MDA)含量检测:取出部分待测骨骼肌组织，称重。以质量体积比1∶9加生理盐水，制备10%组织匀浆，2000r/min离心10min后取上清液。然后根据试剂盒说明书，用生理盐水将上清液按不同指标稀释成最佳测试浓度并检测。匀浆蛋白浓度的测定采用BCA测定法。2)RT-PCR检测骨骼肌Nrf2及Nqo1 mRNA表达水平:取出部分待测骨骼肌组织，称重，Trizol等提取RNA，紫外分光光度法测RNA量及其纯度，按照反转录试剂盒操作步骤行反转录(RT)反应。所得cDNA于RT-PCR仪上进行反应。β-actin引物序列:正义引物5'-GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT-3'，反义引物5'-TGATCCACATCTGCTGGAAGGT-3';Nrf2引物序列:正义引物5'-ATGAGTCGCTTGCCCTGG-3'，反义引物 5'-CTTGTTTTCCGTATTAAGACACTGTAA-3';Nqo1引物序列:正义引物 5'-CTTGCTTTCCATCACCACCG-3'，反义引物 5'-GACGCTTCTTCCACCCTTCC-3'。反应条件为:95℃ 1min;40个循环(95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 45s)，总延伸结束后，进行融解曲线分析，产物电泳。统计△△Ct值并比较各组 mRNA的表达情况。3)Western blot检测:取出部分待测骨骼肌组织，根据核蛋白试剂盒提取核蛋白，RIPA法提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。每孔上样30μg，8%SDS-PAGE电泳后，转膜，封闭。膜于5%脱脂牛奶中的一抗中4℃孵育过夜。然后洗膜并将其置入二抗稀释液中室温孵育1h。ECL试剂加入后曝光，显影，定影，凝胶成像分析仪分别测算目的蛋白与内参蛋白灰度值，并将其比值作为蛋白表达量。

3．统计学方法:SPSS 19．0统计软件进行统计分析，实验数据用均数±标准差(±s)表示。多组间比较用单因素方差分析，组间的两两比较，方差齐性采用LSD检验，方差不齐采用Tamhane's T2检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．人参皂苷Rb1干预对POFS老年大鼠行为学的影响:相比于对照组，模型组于术后第1、3天穿越格子数降低(P＜0．05)，第7天开始恢复，第 1、3、7天休息时间增加(P＜0．05)。相比于模型组，干预组于术后第1、3天穿越格子数开始增加(P＜0．05)，第7天恢复至模型组水平。

2．人参皂苷Rb1干预对POFS老年大鼠骨骼肌SOD活性和MDA含量的影响:相比于对照组，模型组SOD活性于术后第1天有增加趋势，第3、7天明显增加(P＜0．05)，MDA含量于术后6h有增加趋势，于第1、3、7天明显增加(P ＜0．05);相比于模型组，干预组SOD活性于术后6h，第1天有增高趋势，并于第3、7天开始明显增高(P＜0．05)，MDA 含量术后6h基本一致，第1天有降低趋势，并于第3、7天明显下降(P ＜0．05)。

3．人参皂甙Rb1对Nrf2及其下游靶基因 Nqo1 mRNA表达水平的影响:相比于对照组，模型组大鼠骨骼肌Nrf2 mRNA表达量于第1、3天时增加，第7天时恢复至对照组水平，下游靶基因Nqo1 mRNA在6h时表达量降低(P＜0．05)，并于第1、3天时有增加趋势(P＞0．05)，第7天恢复至对照组水平。相比于模型组，干预组Nrf2 mRNA表达水平于术后6h及第1、3天时增高(P＜0．05)，第7天恢复至模型组水平，而Nqo1 mRNA于术后6h及第1天明显增加(P＜0．05)，第3、7天时恢复至模型组水平，结果见表1。

表1 人参皂苷Rb1对POFS大鼠骨骼肌Nrf2及Nqo1 mRNA表达的影响(±s，n=8)

表1 人参皂苷Rb1对POFS大鼠骨骼肌Nrf2及Nqo1 mRNA表达的影响(±s，n=8)

与对照组同期相比，*P＜0．05;与模型组同期相比，#P＜0．05

组别 时间 Nrf2(2-△△CT) Nqo1(2-△△CT )6h 1．07 ±0．44 1．02 ±0．23术后第1 天 1．06 ±0．37 1．05 ±0．37术后第3 天 1．05 ±0．35 1．05 ±0．31术后第7 天 1．06 ±0．48 1．03 ±0．26模型 术后6h 0．97 ±0．34 0．62 ±0．25*术后第1 天 3．30 ±0．84* 1．34 ±0．46术后第3 天 1．61 ±0．48* 1．45 ±0．48术后第7 天 0．99 ±0．25 1．04 ±0．25人参皂苷 术后6h 1．53 ±0．49# 1．06 ±0．32#Rb1干预 术后第1天 5．72±1．37# 2．67±0．76#术后第3 天 2．45 ±0．70# 1．41 ±0．57术后第7天对照 术后0．95 ±0．37 0．94 ±0．26

4．人参皂苷Rb1对 骨骼肌Nrf2活化与转位的影响:相比于对照组，模型组大鼠骨骼肌核内Nrf2蛋白术后各个时间点表达量均增加(P＜0．05)，总Nrf2蛋白于术后6h，第1、3天表达量明显增加(P＜0．05)，第7天时恢复至对照组水平;相比于模型组，干预组核内Nrf2蛋白术后6h，第1、3天表达量明显增加(P＜0．05)，第7天恢复至模型组水平;总Nrf2蛋白术后6h，第1天表达量开始增加(P＜0．05)，第3、7天时恢复至模型组水平。结果见图1、图2。

图1 人参皂苷Rb1对核内nrf2蛋白表达的影响

图2 人参皂苷Rb1对总nrf2蛋白表达的影响

讨 论

术后疲劳综合征其按部位分为外周疲劳和中枢疲劳，其中外周疲劳主要表现为骨骼肌功能下降［8］。有研究发现，骨骼肌ROS的过度生成使得骨骼肌运动功能降低，它是骨骼肌疲劳的重要产生原因［9］。MDA是机体内脂质过氧化的代谢产物，是间接反映氧自由基对机体的损伤程度的重要指标。而SOD作为其中一种重要的抗氧化酶，其活力则间接说明机体抗氧化能力的强弱。本课题组前期研究结果显示，POFS大鼠骨骼肌存在着显著的氧化应激性导致的损伤，而通过提高抗氧化酶活性，减轻氧化应激损伤等作用，人参皂苷Rb1增强了骨骼肌功能从而发挥其抗疲劳的作用［3］。

本实验研究结果表明，模型组大鼠术后穿越格子数减少，休息时间增加;干预组大鼠穿越格子数增加，表明老年大鼠在小肠切除术后出现记忆力学习力减退的症状，处于显著的疲劳状态，与临床上术后病人出现的体力下降，倦怠不适等疲劳症状较为相似，而人参皂苷Rb1则可明显改善上述症状。模型组大鼠MDA含量在术后增加，SOD活性同时增加，干预组大鼠较模型组MDA含量明显降低，SOD活性则明显增加。这说明大鼠术后骨骼肌抗氧化应激能力下降并伴随明显的氧化应激所致的损伤，而人参皂苷Rb1则对此种氧化损伤具有明显保护作用。这与本课题组前期研究结果相似。

Nrf2是一种重要的转录因子，它能促使细胞活性氧降低并抵御有害的外来刺激。在生理状态下，胞质中的Kelch样ECH联合蛋白1(Keap1)联结在Nrf2上，使之失活，而 Nrf2再被诱导激活后，其与Keap1分离并转入细胞核，识别并结合一系列抗氧化反应元件(ARE)，ARE能启动下游相应的Ⅱ相解毒酶基因等的表达，这类基因的表达上升能诱导细胞内一些重要抗氧化物质(如SOD、CAT、GSH等)的表达，这进而提升了外源性毒性物质和自由基的清除与代谢［11］。而作为Nrf2驱动的重要下游靶基因之一，NAD(P)H醌氧化还原酶(Nqo1)是抗氧化应激损伤的代表性组成部分［12］。

研究表明，白藜芦醇能够上调Nrf2表达来促进SOD、CAT等抗氧化酶的水平，这些反应能减轻大鼠原代肝细胞的氧化应激损伤［12］。还有研究发现，在氟中毒早期，机体能通过启动Nrf2/ARE通路，增加SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶的表达，从而提高细胞抵御氧化应激的能力，最终减少机体的氧自由基［13］。本实验研究结果表明，在术后一定时间内，模型组大鼠骨骼肌Nrf2 mRNA表达显著增加，Nrf2核蛋白与总蛋白表达量均增加，而核蛋白尤为显著，而Nqo1 mRNA表达有一定增加趋势，这表明了在POFS所产生的应激状态下，机体在Nrf2/ARE及其下游通路被激活后抗氧化能力增强，这可能是一种机体自身的代偿性保护机制。人参是一种著名的中药，在抗疲劳、调节中枢神经及物质代谢等多方面均有显著功效［15］。人参皂苷Rb1是其具有显著抗氧化作用的重要的有效成分之一。有研究显示，通过启动Nrf2/ARE通路，人参皂苷Rb1能够减少小肠缺血再灌注所致的肾脏损伤［16］。本研究结果显示，与模型组相比，干预组大鼠骨骼肌Nrf2 mRNA表达于术后明显增加，Nrf2核内蛋白与总蛋白表达量均增加，而尤以核蛋白增加较为显著，而Nqo1 mRNA表达明显增加，证实人参皂苷Rb1可上调POFS大鼠骨骼肌Nrf2/ARE通路及其下游基因的表达，发挥其抗氧化应激损伤和细胞保护的作用。

综上所述，术后一段时间内，通过激活 Nrf2/ARE通路，人参皂苷Rb1能降低POFS老年大鼠骨骼肌氧化应激所致的损伤，从而发挥抗术后疲劳作用。

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