双歧杆菌分子分型鉴定研究进展

刘洋,张清平,段文锋

(上海市质量监督检验技术研究院 国家食品质量监督检验中心(上海)，上海200233)

0 引 言

双歧杆菌是能在人和动物肠道内定植的益生菌，最早由法国巴斯德研究所Tissier博士于1899年首次从母乳喂养儿的粪便中分离发现，1924年命名为双歧杆菌属(Bifidobacterium)[1]。大量研究表明，双歧杆菌能抑制致病菌入侵和定植、调节机体免疫、降低胆固醇、抑制肿瘤发生等，在维持机体肠道微生态平衡和宿主健康方面发挥着重要的作用。因此，双歧杆菌成为近年来食品、药品研究开发的热点，部分菌株大量用于婴幼儿配方食品、保健食品、药品的生产中。但双歧杆菌发挥有益功能具有很强的菌株特异性，为此FAO/WHO益生菌评价指南中指出，精确的菌株识别是益生菌使用的前提[2]，因此，双歧杆菌的分类鉴定一直是研究的重点和热点。近年来，分子生物学方法成为双歧杆菌分类鉴定的主要手段，本文就目前常用的分子分型鉴定技术特点和应用进展进行介绍。

1 双歧杆菌属的分类学进展

微生物分类是不断发展变化的动态过程，双歧杆菌也不例外[3-5]。早期的属水平的鉴别方法都局限于形态学和生理生化方法，而双歧杆菌属的特征又很多样化。从发现到20世纪中期，双歧杆菌先后被划入芽孢杆菌属、乳杆菌属、拟杆菌属、放线菌属[4]。近30多年，分子生物学技术高速发展，从Scardovi最早利用DNADNA杂交的方法研究双歧杆菌的分类开始，双歧杆菌属的命名从表型进入了遗传型阶段[6]。2004年，Liesbeth等根据DNA-DNA杂交、扩增片段长度多态性、atpD及groEL基因序列分析等将乳双歧杆菌(B.lactis)重新划分为动物双歧杆菌乳亚种(B.animalis subsp.lactis)[7]；2008年，Mattarelli等根据DNA-DNA杂交、16S rDNA及hsp60基因序列分析、随机扩增长度多态性、BOXPCR、变性梯度凝胶电泳等数据，将长双歧杆菌(B.longum)重新划分为3个亚种：长双歧杆菌长亚种(B.longum subsp.longum)、长双歧杆菌婴儿亚种 (B.longum subsp.in fantis)、长双歧杆菌猪亚种(B.longum subsp.suis)[8]。 2011年，Hidetoshi等发表了双歧杆菌属的一个新种B.kashiwanohense[9]。 2012年，Akihito Endo等发布了5个新种，B.reuteri,B.callitrichos,B.saguini,B.stellenboschense和B.biavatii[10]。截止目前，该属包含41个种，9个亚种，模式种为两歧双歧杆菌(B.bifidum)。

2 双歧杆菌属的分子分型鉴定方法

目前，根据分子分型技术的原理不同主要可分为2大类，分别为基于测序的分型鉴定方法，基于DNA印迹的分型鉴定方法。其中基于测序的方法主要如16S rDNA和16S-23S rDNA间区序列分析、多位点测序分型方法(Multilocus sequence typing,MLST)。基于DNA印迹的方法又分为2小类，一类为无需PCR而直接根据基因组序列特征分型，如脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)、限制性片段长度多态性 分 析 (Restriction fragment length polymorphisms,RFLP)；一类为基于PCR技术的印迹法，如随机扩增多态性DNA技术 (Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)、扩增片段长度多态性分析(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)、rep-PCR方法(Repetitive ExtragenicPalindromic PCR,REP-PCR)。

2.1 基于测序的分型鉴定方法

2.1.1 16S rDNA和16S-23S rDNA ITS序列分析

16S rDNA序列分析是目前细菌分类鉴定中最常用和必须进行的一种鉴定分析方法，能确定细菌的新的分类命名地位。主要步骤包括：基因组DNA提取、16S rDNA的扩增、16S rDNA基因测序和序列分析。将目标序列与基因数据库中16S rDNA序列比对，分析相似度和进化关系，确定分类地位。一般认为，16S rDNA序列93%～99%的相似度可认为是具有紧密亲缘关系，有别于其他菌属[11]。Stackebrandt等提出同种的16S rDNA基因序列同源性应大于97%，作为种水平的判别标准[6]。双歧杆菌属的16S rDNA序列相似度介于87.7%～99.5%之间，部分长双歧杆菌、动物双歧相似度达到99%以上，不具备种内区分双歧杆菌的能力[12]。王涛等利用16S rDNA对人体粪便中分离的1株双歧杆菌进行鉴定[13]。高鹏飞等利用16S rDNA对从12位健康蒙古族儿童粪便中分离得到11株双歧杆菌进行鉴定，发现B.animalis V9与乳双歧杆菌BB12的同源性为99%，有望在乳制品和保健产品中广泛应用[14]。近年来，二代测序技术的发展，使得益生菌菌群分析进行高通量时代。Gulitz等研究者利用基于焦磷酸测序的16S rDNA分析对水开菲尔(water kefir)发酵饮料进行菌群分析，发现大量的嗜冷双歧杆菌(B.psychraerophilum)，针对16S rDNA的高通量测序技术将成为对发酵食品菌群进行深度分析的有力工具[15]。

16S rDNA和23S rDNA基因之间的区域，称为内部转录间隔区(Internally transcribed spacer，ITS)，较16S rDNA和23S rDNA进化快，不同菌的序列长度和碱基差异较大，用于区分和鉴定亲缘关系相近的种和菌株，是目前种及亚种水平鉴定最可信和准确的方法之一。主要步骤为：根据16S rDNA和23S rDNA末端的保守序列设计引物、对ITS序列进行扩增、对扩增产物测序并进行序列分析。该方法广泛用于双歧杆菌的分类鉴定及多态性研究中。Francesca等研究者利用16S rDNA和16S-23S ITS序列对人类肠道黏膜和粪便中900个分离菌株进行鉴定，发现了704株双歧杆菌，主要有长双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌等6种，在粪便、黏膜等肠道不同环境中分布有差异[16]。LI等通过表型鉴定、16S rDNA和16S-23S ITS从10株双歧杆菌中筛选出动物双歧杆菌乳亚种Qq08菌株，具有耐氧、耐酸和耐胆汁盐能力，比商业化益生菌株BB12特性更好[17]。

2.1.2 半保守基因序列分析

除了16S rDNA和16S-23S rDNA ITS序列外，研究者也寻找到其他保守性略低的基因，通过测序分析，对菌种进行有效区分。如recA基因中一段300 bp的片段，有足够的信息可用于双歧杆菌属大部分种的区分，还能对相近的种如动物双杆杆菌乳亚种和动物亚种区分[18]。 16S rDNA、16S-23S rDNA ITS结合这些保守基因的序列分析，可在种及亚种水平对双歧杆菌进行较精确的分型鉴定。Byoung等提出rpoB基因序列相似度84.1%～99.0%时，可以作为双歧杆菌鉴定的有效分子标签[19]。Loredana等利用hsp60基因对双歧杆菌进行鉴定，认为该基因具有种及亚种水平的分辨力[20]。Sheu等采用tuf基因引物实现对发酵乳中双歧杆菌部分种的分子鉴定[21]。 另外，还有groEL，recA，atpD，dnaK，grpE等基因。但是该类单基因分子尚无完善的数据库，不足以提供全面的进化分析信息，菌株水平区分能力不够；且由于缺乏有效的保守区域，基于这些基因设计种特异分型引物存在一定困难。

2.1.3 多位点测序分型

多位点测序分型 (Multilocus Sequence Typing，MLST)技术是1998年Maiden等提出，近年来发展较快的一种分子分型方法[22]。它选择多个编码蛋白的管家基因，进行序列测定，分析等位基因图谱，进行聚类分析，根据位点序列赋予不同菌株序列型(Sequence type，ST)，对菌株进行多位点的精确分型。最早的MLST序列测定450 bp，基因个数7～10个，具有较好的分辨能力。与其他方法相比，该技术是标准化的测序技术；操作简便，重复性好；数据能共享、动态补充和互相比较；分型精度可以和PFGE相媲美，达到菌株水平。目前全球共有4个较大的公共MLST数据库(www.pasteur.fr/mlst，http://pubmlst.org/，http://www.mlst.net/，http://mlst.ucc.ie/)。

关于双歧杆菌的MLST研究刚刚起步。2006年，Marco等人选择7个保守的管家基因，clpC，dnaB，dnaG，dnaJ1，purF，rpoC和xfp，对双歧杆菌常见种的模式菌株进行进化分析，比较7个基因建立的系统发育树，结果比单基因建树结果更全面、合理[12]。2010年，Alexis等研究者对119株动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌进行clpC、purF等7个管家基因的MLST分析，共获得104个ST型别，在两歧双歧、长双歧、短双歧种间区分度达到99%，具有精确菌株分型的能力[23]。 2011年，Hiroshi利用MLST和AFLP技术对母体中长双歧杆菌转移到婴儿体内的过程进行溯源分析[24]。鉴于MLST方法能综合多个管家基因的进化信息、易于标准化操作等诸多优点，有望成为双歧杆菌进化分析的强有力的工具。

2.2 DNA印迹方法

2.2.1 直接针对基因组的DNA印迹方法

(1)脉冲场凝胶电泳。

脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE)是目前菌株鉴定，包括双歧杆菌鉴定的金标准方法。其操作步骤为：细菌培养后在琼脂糖凝胶块中裂解，用稀有酶切位点的内切酶作用，脉冲场凝胶电泳分离。DNA带谱反映了目标基因组特异的序列分布，可以作为分型的依据。该方法能反映双歧杆菌全基因组中较多的变异信息，具有重复性好、分辨率高、结果稳定等优点，比16S rDNA方法分辨力更高，具备菌株水平溯源能力，是菌株多相鉴定技术的常用方法之一。

PFGE自1996年用于双歧杆菌的分型鉴定中。2006年，Briczinski等改进了双歧杆菌PFGE技术的条件，大大缩短了该方法的操作时间[25]。Marius等对市售益生菌乳制品中的双歧杆菌进行计数分析，并用PFGE分析对包括酸乳在内的乳制品中双歧杆菌鉴定，发现所有分离菌株和BB12等3个商业菌株谱型一致，均为动物双歧杆菌，推测不同名称的商业菌株可能来源相同[26]。Kheadr等利用PFGE法对14株母乳喂养新生儿体内分离的双歧杆菌进行分子鉴定，16S rDNA技术发现这些分离株与thermacidophilum猪亚种有98%-99%的相似性，进一步用PFGE分析将其分为4种酶切图谱，认为该类亚种在新生儿体内的存在将帮助形成婴儿的肠道生境[27]。Aires等利用PFGE和BOX-PCR对15个婴儿体内动态收集4次获得的双歧杆菌进行分析，发现不同婴儿体内有不同的双杆杆菌优势菌种，随着时间而变化，利用该法可以对婴儿体内双歧杆菌菌群分布进行动态分析，用于调节婴儿饮食方案[28]。但PFGE的不足为操作复杂、步骤繁琐、需要特殊设备和易受操作者经验影响，是该法的应用限制。

(2)限制性片段长度多态性分析。

限制性片段长度多态性分析 (Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP) 于1980年最先提出，是发展最早的DNA印迹技术之一。主要步骤为：限制性内切酶切割基因组DNA、凝胶电泳、转膜、探针标记特定DNA片段。DNA片段数目和长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布。是可用于种间鉴定的一种DNA指纹方法。

目前，传统的RFLP技术使用较少，常与PCR联用，称为PCR-RFLP。即先针对16S rDNA或其他靶标基因设计扩增引物，再对扩增片段酶切，从而把不同多态性的菌株序列区分开来。该方法既利用了PCR的片段选择特异性，又发挥了RFLP对多态性的分析能力，比单个技术的分辨力要高。Loredana等建立了一种针对hsp60基因的PCR-RFLP方法，先用引物扩增hsp60基因中一段590 bp的片段，而后用HaeⅢ对扩增产物酶切，能对25个双歧杆菌不同的种，以及动物双歧、假长双歧杆菌的部分亚种进行区分[20]。还有一种新的非培养的低分辨群落分析技术也基于RFLP，称为T-RFLP。该方法在扩增引物的一端加上荧光标记，对目标序列扩增后再酶切，而后用专门的读图设备分析锋形，与模式菌株纯培养制备的锋形比较，通过软件的计算获得混合样本中的细菌群落分布情况，分型水平到属或属以下。Fei Sjoberg等利用T-RFLP技术和培养方法比较分析了部分出生1周到12个月的婴儿粪便，认为T-RFLP方法对不可培养厌氧菌种的检测更加稳定，为一种灵敏、具备合适区分力的肠道微生物组成分析方法[29]。

2.2.2 基于PCR的DNA印迹方法

(1)随机扩增多态性DNA技术。

随机扩增多态性DNA (Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)技术是由WILLIAMS和WELSH同时发展起来的一种DNA标记技术。其原理是针对目标菌株基因组DNA，以单一的随机寡核苷酸序列为引物进行PCR扩增，片段经凝胶电泳分离后呈现出DNA指纹图谱，分析基因组多态性特征对菌株分类鉴定。RAPD技术可在基因组序列未知的情况下进行，设计和实验简单，在双歧杆菌鉴定中应用广泛。

董明盛采用RAPD技术，用10条引物对7种9株双歧杆菌基因组进行PCR扩增,发现引物S256对双歧杆菌种及同种不同株均具有良好的区分能力，由扩增图谱建立的聚类树状图能准确反映双歧杆菌的系统发育关系[30]。Hidenori等研究者用RAPD技术对母亲和哺乳婴儿体内分离的各50株短双歧杆菌进行多态性分析，发现部分母体短双岐杆菌转移到婴儿体内，成为婴儿肠道早期定植菌，具有更高的生长活力[31]。但早期的RAPD引物为非特异性，扩增受到PCR条件等多重因素影响，重复性和稳定性相对较低。近年来，研究者筛选更多的RAPD引物，挑选出菌株特异的区分引物，提高了传统RAPD方法的分型精度，达到菌株水平。如Toshimitsu等筛选了97对RAPD引物，挑选出能特异区分两歧双歧杆菌OLB6378的菌株特异性RAPD引物，可用于该特定菌株的检测和计数[32]。

(2)扩增片段长度多态性分析。

扩增片段长度多态性分析 (Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)是一种建立在PCR技术和RFLP技术基础上的检测DNA多态性的分子分型技术。其主要步骤为：先对基因组DNA经限制性内切酶双酶切；将含有粘性末端的接头与酶切片段连接，作为扩增模板；以特异接头序列作为引物PCR，获得不同长度的扩增片段；凝胶电泳分离后对图谱分析进行菌种鉴定。该技术既具有RAPD技术的高效性和方便性，又兼顾RFLP技术的可靠性和重复性，能对部分遗传关系相近的双歧杆菌进行区分。Dimitrov利用XhoⅠ和TaqⅠ两个酶，建立了一种具有高度菌株特异性的AFLP分型方法，对20个分离自健康人体的双歧杆菌鉴定，结果比PFGE的分辨力更高，操作也更简便[33]。Hiroshi等利用AFLP和MLST方法，对8对母亲和婴儿的长双歧杆菌进行追溯，发现其中11个长双歧杆菌长双歧亚种在母亲和婴儿的粪便中是同型的，这些菌株从出生后就定植在婴儿的肠道内，具有母体-婴儿的家族特异性[24]。

(3)细菌基因组重复序列PCR技术。

细菌基因组重复序列PCR技术 (Repetitive DNA element PCR，Rep PCR)是1996年首先提出，主要原理是对细菌DNA中广泛分布的短重复序列 (长度从30-40bp到150bp不等)扩增，电泳分析产物条带，从而揭示基因组DNA之间的差异。主要有基因外重复回文系列(Repetitive Extragenic Palindromic，REP)、肠杆菌基因间重复一致序列 (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC)和BOX插入因子等几类。Rep-PCR技术操作简单，分辨效果好，可自动化，并可建立菌种REP-PCR、ERIC-PCR分型数据库，近年来发展较快，也有学者将其应用于双歧杆菌分类鉴定中。

Ventura等利用ERIC-PCR对26个菌种的89个菌株进行分析，发现该方法能对大部分菌种有效区分，但对相近的种区分力较低，如链状双歧杆菌和假链状双歧杆菌[34]。Masco等用BOX-PCR技术对128个双歧杆菌模式菌株、参考菌株和分离菌株鉴定，发现BOXA1R引物的区分力最佳，能在种和亚种水平，部分甚至在菌株水平鉴定，重现率高达92.5%～97%[35]。Waligora等利用Masco建立的BOX-PCR和多重PCR方法，对10个法国过敏症婴儿和20个对照者的胎粪中菌群分析，发现两组婴儿的菌种构成无明显差别，都有大量的双歧杆菌分布，双歧杆菌的多样性和过敏状态之间无明显关联[36]。

3 结束语

随着食品工业的快速发展，双歧杆菌作为益生菌的一大类，已用于多种食品的开发，包括婴幼儿配方乳粉。因为益生菌作用具有菌株特异性，精确的菌株鉴定技术不仅是各国学者研究的重点，也将成为我国益生菌食品安全监管的必然需求。传统的生理生化技术已经不能满足精确的分型鉴定要求，但仍然作为标准方法用于培养和初步分型。各种分子生物学技术成为双歧杆菌分型鉴定的主流方法。

未来的双歧杆菌分类鉴定中，基因组序列的直接测定将成为重要的发展方向，特殊半保守基因序列分析将成为16S rDNA序列分型的有力补充。MLST技术因为涵盖更多的基因信息和易于全球共享数据的模式，在双歧杆菌鉴定和相关研究中的应用将更广泛。传统的DNA印迹方法对于基因组中较大的差异有全局反映，但不能提供菌种以下的分辨力，应用将受到局限。基于细菌特异重复序列的rep-PCR以及改良过的DNA印迹方法如特异菌株位点RAPD、AFLP技术具有亚种或菌株水平的分辨力，将成为PFGE方法的优良候选。随着双歧杆菌基因组数据的不断扩充，比较基因组分析将有助于开发精确的菌株鉴定技术，二代测序技术将在复杂生境下菌群快速分析中发挥更重要的作用。但无论哪一种方法，都应当与其他方法互为补充，取长补短，多相分型依然是重要的分型鉴定思路。

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