病原体相关分子模式与免疫识别受体研究进展①

陶志云 施祖灏 朱春红 宋卫涛 宋 迟 秦爱建 (扬州大学兽医学院，扬州225009)

病原体相关分子模式与免疫识别受体研究进展①

陶志云 施祖灏②朱春红②宋卫涛②宋 迟②秦爱建 (扬州大学兽医学院，扬州225009)

对“自我”和“非我”的区分是免疫系统抵抗病原侵入和维持机体处于平衡状态的先决条件。1989年，美国耶鲁大学免疫学家Janeway在冷泉港会议上提出了细菌、病毒、真菌等外来微生物存在与机体完全不同的独特结构成分，即病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，而机体内的天然免疫系统细胞上存在可识别PAMP的模式识别受体(Pattern-recognition receptors，PRRs)这一假说[1]。1996 年 Hoffmann 等[2，3]通过对含 Toll基因突变的果蝇研究证实了这一假说。

天然免疫系统的识别机制近年来已成为免疫学的研究热点，从文献检索结果来看每年都有大量相关文献报道，新型的识别受体不断被发现和确证。目前已发现的模式识别受体可以分为六大类[4]:第一类是Toll样受体家族(Toll-like receptors，TLRs);第二类是识别RNA受体家族，包括维甲酸诱导基因Ⅰ样受体家族[Retinoic-acid-inducible geneⅠ(RIG-Ⅰ)-like receptors，RLRs]和蛋白激酶R(RNA-activated protein kinase R，PKR);第三类是识别DNA受体家族;第四类是主要识别肽聚糖的核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族[Nucleotide-binding oligomerization domain(NOD)-like receptors，NLRs];第五类是C型凝集素受体家族;第六类是其他一些固有免疫特异性PRRs。有关这些PRRs的研究进展，有许多文章对其进行了综述，但这些综述性文章基本都如前所述从PRRs的结构类型来进行阐述。现有研究表明，一些致病菌和病毒可以逃避固有免疫应答，而且并不是所有的PRRs都可以被刺激并启动适应性免疫应答，因此，对病原体相关分子模式化学结构的更多了解将会帮助解释PRRs兴奋或抑制对结构的需要，为新型PRRs的发现以及免疫治疗药物的开发提供相关信息[5]。本文将从病原体分子模式的角度进行阐述，并通过对病原体分子模式的分析，为研究者提供新的思考角度和观念。

1 脂类化合物

细菌细胞壁中的组成成分如脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)、脂磷壁酸(Lipoteichoic acid，LTA)和脂阿拉伯甘露聚糖(Lipoarabinomannan，LAM)，均属于脂类化合物。脂质的主要成分为脂肪酸，后者包括饱和脂肪酸(Saturated Fatty Acid，SFAs)、单不饱和脂肪酸(Monounsaturated fatty acid，MUFAs)与多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)。细菌脂质的脂肪酸组成与宿主动物的明显不同，如动物体内含量很高的油酸和棕榈油酸，但在很多细菌中均不存在或含量极低。虽然目前这一脂肪酸组成模式的差异对模式识别受体的激活具有何种特殊意义还不明确，但弄清这一机制将为防治病原体感染、营养免疫调控研究提供新的思路。

LPS是PAMPs中最具有代表性的分子，是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，又称为细菌内毒素，其中类脂A是LPS的活性成分，类脂A由D-氨基葡萄糖双糖骨架和以酯键和酰胺键连接的长链脂肪酸组成，脂肪酸的组成可能通过影响类脂A的构象决定其与受体结合的特异性。来源于肠道杆菌科的Cannical脂质A包含有6个脂肪酸，常作为一种激动剂被TLR4识别，而来源于R.spheroides的包含4个脂肪酸的脂质A，对于TLR4则是一种拮抗剂。来源于不同物种的脂肪酸显示出不同的免疫刺激活性，这和它的亲脂性和病原性是密切相关的[6-8]。

磷壁酸是革兰氏阳性菌细胞壁特殊组份，在体内与CD14结合形成LTA-CD14复合物，LTA-CD14复合物又与LAP蛋白结合形成LTA-CD14-LAP复合物，LTA-CD14-LAP复合物通过TLRs进行信号传导。目前已确认的可识别LTA的模式识别受体包括 TLR2 和 TLR6[9，10]，与 TLR4 一样，TLR2 和 TLR6也表达于细胞膜。

细菌外壁的LPS、LTA也能被巨噬细胞表面的清道夫受体如SR-AⅠ、SR-AⅡ和MARCO等识别，激活巨噬细胞吞噬活性[11]。

有研究认为，动物机体的内源性脂质也可以被PRRs所识别，如低密度脂蛋白可分别被 TLR4、TLR2和清道夫受体识别，启动炎性信号通路，从而调节体内代谢及炎性基因表达，并与多种生理或病理状态相关，如参与动脉粥样硬化的形成[12-14]。当TLR2、TLR4、TLR6基因突变，饱和脂肪酸诱导的炎性基因表达也受到抑制;而多不饱和脂肪酸或脱酰基后的饱和脂肪酸不仅能逃避TLR2、TLR4的识别，甚至能抑制这些TLRs的活性[15]。

2 糖类化合物

多糖(Polysaccharides)是自然界中含量最丰富的生物聚合物，广泛分布于植物、动物和微生物中。能够刺激巨噬细胞免疫应答的生物多糖主要可分为β-葡聚糖和高支化度的杂多糖两大类，如存在于病原性微生物的多糖类化合物有脂多糖、肽聚糖、脂阿拉伯甘露聚糖、荚膜多糖、酵母多糖等[16]。

肽聚糖存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁中。肽聚糖的骨架是由两种糖衍生物:N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)和 N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid，MurNAc)交替相连而形成的多糖链，这些链相互交联形成肽聚糖。并不是所有细菌都具有相同的胞壁质，它们在肽链的氨基酸组成上会有不同。其中仅存在于G-细菌的γ-右旋谷氨酰-内消旋二氨基庚二酸多肽(Meso-DAP)可被NOD1识别，而同时存在于G+和G-的胞壁酰二肽(Muramyl dipeptide，MDP)可以被 NOD2识别[17-19]。NOD1和NOD2是最先被报道的能够识别胞质内PAMP的NLRs，分别含有1个和2个N末端CARD效应结构域。NOD识别肽聚糖的机制还不清楚，尚未证实它们之间可发生直接结合，很可能胞壁肽聚糖是通过一种连接蛋白以间接的形式与NOD结合。

脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)，尤其是带有甘露糖帽的脂阿拉伯甘露聚糖，是慢性生长的分枝杆菌细胞壁上的重要糖脂，如结核分枝杆菌。LAM的模式识别受体为TLR2和甘露糖受体。有研究显示，来自于牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的LAM能够通过甘露糖受体所传递的胞内信号抑制TLRs的信号通路[20]。

存在于真菌的细胞壁中的酵母多糖也是重要的PAMPs，目前已报道可识别酵母多糖的 PRRs有TOLL样受体家族的TLR2、TLR6;C型凝集素受体家族(CLRs)的 Dectin-1、Dectin-2、甘露糖受体和CARD9(Caspase recruitment domain9)[4，20-22]。CLRs是一类新的非Toll样PRRs，CLRs与配体结合后，可通过Syk(酪氨酸激酶)依赖和Syk非依赖两种通路激活下游信号，这是一较为新颖的信号传导途径，其下游传导机制目前还不是很清楚。

3 蛋白质或多肽

病原性微生物均营寄生性生活，其组织形态和新陈代谢与宿主差异显著，在蛋白质结构上也表现出明显的不同。微生物蛋白质往往都具有较强的免疫原性，其氨基酸组成与宿主差异明显。存在于细菌胞膜上的脂蛋白、脂多肽、鞭毛蛋白、病毒衣壳上的衣壳蛋白和融合蛋白均是重要的PAMPs。

细菌脂蛋白位于细菌外膜的内层，连接着磷脂双分子层与肽聚糖层。复旦大学储以微教授课题组报道，细菌脂蛋白一旦与存在于T淋巴细胞表面的TLR2受体“一对一配接”后，可以调动一群具有杀伤性T淋巴细胞，明显增强其杀伤癌细胞的能力，同时，这种“一对一配接”还可以削弱和抑制另外一群调节性 T淋巴细胞“保护癌细胞”的能力[23]。TLR2与TLR1或TLR6结合形成异源二聚体后，可以分别识别三酰基脂多肽和二酰基脂多肽。这样的组合不仅能改变所识别决定簇的特异性，也能改变所启动信号的性质和强度。9个TLRs形成的同源或异源二聚体共29个。RP105(Radioprotective 105 kD protein)是具有和TLRs胞外区同源结构的蛋白质，对它的研究提示TLRs可能潜在地联结成比二聚体更大的复合物，因而这就说明有非常庞大的组合库的可能性[24，25]。

鞭毛蛋白(Flagellin)是构成细菌的鞭毛纤维的粒状蛋白质。其分子量可因菌种而异，肠细菌群的是5～6万，而芽孢杆菌属据报道为3万左右。这种蛋白质的氨基酸组成也因菌种而异，但都含有多量的天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸，而不含半胱氨酸和色氨酸。Hayashi等[26]将细菌脂肽、脂多糖、酵母颗粒、鞭毛蛋白等刺激物加入转染TLR5表达载体的小鼠巨噬细胞培养基，进行孵育，应用流式细胞分离技术测定TNF-α的水平，结果显示，不同种类细菌的鞭毛蛋白均可刺激TLR5的活性，而其他刺激物无此活性，确定了TLR5的配体为鞭毛蛋白。最近的研究发现，进入胞质的沙门氏菌鞭毛蛋白能够通过ICE-蛋白酶活化因子(ICE-protease-activating factor，IPAF)，活化下游一系列信号分子，而不依赖于TLR5，但目前对于IPAF是否直接识别鞭毛蛋白还不明确[26-28]。NAIP5(Neuronal apoptosis inhibitory protein 5)与IPAF结构相似，同属于NLRs家族。进入胞质的军团菌的鞭毛蛋白也能够激活NAIP5[29，30]。但其他的胞内菌如志贺菌属是否也能活化这些NLRs，以及IPAF和NAIP5炎性复合体介导的细胞死亡的具体机制均有待进一步深入研究[31]。

呼吸道合胞病毒的融合蛋白和小鼠乳房肿瘤病毒的衣壳蛋白均能激活 TLR4[32，33]。来自于弓形虫的穿孔素样分子对 TLR11具有激活能力[34，35]。此外，机体本身的纤维蛋白原、热休克蛋白70、热休克蛋白60和纤连蛋白等均能激活TLR4产生炎性反应，显示在机体受到损伤或应激状态，会激活固有免疫系统产生损伤和抗损伤反应[36，37]。

在李斯特菌等细菌上清液中存在一种甲酰化多肽——fMLP(甲酰甲硫氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸三肽)，可与吞噬细胞表面甲酰肽受体(N-formyl peptide receptor，FPR)结合，引发一系列G蛋白介导的信号，继而诱发细胞黏附、趋化、释放活性氧产物、吞噬及杀伤细菌[38]。研究人员曾用破坏了FPR的小鼠做实验，发现fMLP刺激不能引起中性粒细胞的趋化反应，这些小鼠对李斯特菌的易感性也增强;用细菌注射这些小鼠，2天后发现其脾脏有细菌生长，这恰恰发生在特异性细胞免疫产生之前，因此推测FPR的缺乏可能抑制天然免疫应答[39]。FPR除了表达于单核细胞和中性粒细胞表面，其在非吞噬细胞如造血干细胞、表皮细胞、淋巴细胞等也有表达。有理由推测FPR不仅参与机体对细菌感染的抵御，还可能参与了新陈代谢、造血、内分泌等活动[40]。

4 核糖核酸RNA

病毒感染是威胁动物健康的重要危险因素之一。病毒感染机体后通过大量复制寄生于宿主，在与宿主的免疫系统抗衡的过程中能够通过各种方式麻痹宿主免疫系统，逃避监视。有些病毒甚至能够利用宿主的某些蛋白成分为自身的生存复制所用，因此，相对于细菌来说，病毒更为“狡猾”与“隐蔽”，对于动物和人体健康的威胁也更大。

目前发现能够识别RNA病毒的模式识别受体包括 TLR 家族的 TLR3、TLR7 和 TLR8[41];NLR 家族的 NALP3[42];维甲酸诱导基因 I样受体家族(RLRs)的RIG-Ⅰ、黑色素瘤分化相关抗原5(Melanoma differentiation-associated gene 5，MDA)和遗传学和生理学实验室蛋白2(Laboratory of genetics and physiology 2，LGP2)[43];RNA 活化蛋白激酶(RNA-activated protein kinase，PKR)[44]。RNA 病毒分为双链RNA病毒(dsRNA)和单链RNA病毒(ssRNA)，它们在体内被不同的PRRs所识别。

为确定 dsRNA 受体，Kulka等[45]将 TLR1-6和TLR9分别与NF-κB报告基因共转染293细胞，观察转染细胞对polyI∶C的反应性，发现仅表达TLR3的293细胞对其起反应，而其他的TLR均不起作用，表明TLR3有结合polyI∶C的功能。

Lee等[46]发现几种鸟苷酸类似物能够通过TLR7介导细胞的激活，此后，Heil等也发现HIV基因组中富含鸟苷酸和尿嘧啶的ssRNA寡聚核苷酸能够刺激DCs和巨噬细胞分泌IFN-α和一些炎性细胞因子，并通过Toll样受体基因缺失小鼠和遗传互补技术证明了鼠的TLR7和人的TLR8介导了树突状细胞和巨噬细胞对ssRNA的识别[47]。非病毒源ssRNA(如poly U)也能通过与TLR7相互作用而诱导一些炎性因子的产生。由此，科学家们都普遍认为TLR7和TLR8是识别病毒相关ssRNA这一病原相关分子模式的识别受体[48]。

病毒RNA的结构修饰对受体识别也有重要影响。最初，学者们研究发现病毒在宿主体内产生的dsRNA或结合一些人工合成的dsRNA，如poly I∶C和poly A∶U等能够被RIG-Ⅰ受体的C端RNA结合结构域结合。但这些dsRNA都不能使RIG-Ⅰ活化，这说明dsRNA与RIG-Ⅰ的结合对于其活化是不充分的。直到 2006 年，Hornung[49]和 Pichlmair[50]同时报道证明dsRNA刺激RIG-Ⅰ活化的关键决定因素是dsRNA的两条链或一条链的5’-端存在游离的三磷酸基团。这在一定程度上解释了RIG-Ⅰ病毒识别的特异性问题，如流感病毒、狂犬病病毒及水疱性口炎病毒的单链RNA基因组都具有5’-三磷酸基团，故它们能够与RIG-Ⅰ结合并活化RIG-Ⅰ。RIG-Ⅰ活化对于dsRNA 5’-磷酸基团的需求性也解释了微RNA病毒 (Picornavirus)不能介导RIG-Ⅰ反应的现象，因为微RNA病毒基 组RNA的5’-端与病毒的末端结合蛋白VPg(Viral protein genomelinked)结合从而缺乏5’-三磷酸基团[51]。

细菌在合成其蛋白质的过程中也会产生mRNA，有研究报道其可以被 NLR家族的 NALP3 (NACHT，LRR and PYD domains-containing protein 3)受体所识别[52]。

5 脱氧核糖核酸DNA

早在1908年，诺贝尔奖得主，固有免疫的发现者Mechnikov就曾提出核酸能够招募吞噬细胞，但一百多年后，我们对DNA引起的固有免疫反应的具体机制仍不是十分了解。

来自包括细菌和真菌等不同生物的DNA，含有在哺乳动物中少见的CpG-DNA模序，它们在这类动物中被视为“异己”并诱发宿主防御系统应答。CpG-DNA是一些具有免疫激活功能的以未甲基化的CpG基序为核心的DNA序列，它包括含CpG基序的人工合成的寡聚脱氧核苷酸(Oligodeoxynucleotides，ODN)和自然界中细菌、病毒、无脊椎动物等低等生物的基因组DNA[53]。CpG基序(CpG motifs)是指一类以非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸为核心的寡聚脱氧核糖核苷酸，其碱基排列大多遵循以下规律:5′端为2个嘌呤，3′端为2个嘧啶。研究表明[54]，这种序列可激活多种免疫效应细胞，其特征结构如CpG核心、侧翼序列、骨架长度等都对其免疫刺激特性有重要影响。原核生物细菌DNA含有高频率的CpG双核苷，约为1/16，细菌DNA和某些含非甲基化CpG双核苷的多聚核苷酸能够刺激鼠和人淋巴细胞。高等脊椎动物出现CpG双核苷频率为1/50，且多为甲基化，真核细胞和甲基化的多聚核苷酸则不能刺激鼠和人淋巴细胞。CpG结构与细菌DNA同源性要高于脊椎动物细胞。CpG DNA可直接刺激B细胞、巨噬细胞和树突状细胞分泌细胞因子[55]。特别是TH1样细胞因子如IL-12和IL-18;细胞表达协同刺激因子分子，显示增强抗原递呈作用。

最近证实TLR9对应答外源DNA(无论在体内还是在体外)都是必需的[56]。Akira和他的同事们[57]从具有CpG DNA的TLR9缺陷鼠中提出巨噬细胞、DC细胞及B细胞，并发现它们不能进行免疫应答，而且TLR9缺陷动物本身能够抵抗由CpG DNA引起的毒素性休克。这些结果都清楚地提示对CpG寡聚核苷酸酶应答时需要TLR9，进一步的研究将会得知TLR9对宿主防御感染或归因于CpG DNA的不同的免疫调节活动(包括其作为佐剂引发偏向抗体产生和Th1型细胞因子的适应性免疫应答的能力)有多大程度的影响。

最近的研究结果显示，除了TLR9外，还有三类新被发现的识别病毒DNA的模式识别受体家族，即DNA依赖的干扰素调节因子激活物(DNA dependent activator of IFN-regulatory factors，DAI)，黑色素瘤缺失因子2(Absent in melanoma 2，Aim)，DNA依赖性RNA聚合酶Ⅲ(DNA-dependent RNA polymeraseⅢ，PolⅢ)[58]。其中 DAI受体识别 dsDNA 后能诱导Ⅰ型干扰素(Interferon，IFN)的分泌产生免疫效应，但其具体信号通路目前还不清楚。且有研究显示DAI基因缺失小鼠在病毒感染后产生Ⅰ型干扰素的能力几乎不受影响[59]，因此对于DAI在病毒DNA识别中的确切作用受到怀疑，这也反映出了机体抗御病毒感染机制的复杂性。AIM2并不直接诱导IFN的产生，在结合DNA后，其与含有CARD的凋亡相关微粒样蛋白(ASC)结合，形成炎性复合体，继而引起NF-κB和caspase-1的活化，诱导促炎因子的分泌。

6 微生物小分子代谢物

随着对固有免疫识别机制研究的深入，更多的病原体相关分子模式正在被不断发现。在最近的《自然》杂志上，来自澳大利亚的研究团队发现维生素B的细菌代谢产物可以激活一类称作黏膜相关恒定T细胞(Mucosa-associated invariant T cells MAITs)的免疫T细胞，首次表明了维生素可以充当抗原[60]。Kjer-Nielsen等通过确定 MHC相关蛋白MR1(MHC-related protein 1)结合一种叶酸代谢产物6-formyl pterin(6-FP)的晶体结构鉴别了MR1递呈的抗原。目前对于这一抗原递呈过程与免疫、微生物的关联机制还不完全清楚。不过之前有研究发现:生成6-FP的代谢信号通路似乎只存在于之前发现的可激活MAIT细胞的微生物中。

近期山东大学的研究人员也在这方面获得了重要成果，他们揭示了人体先天免疫相关蛋白STING (Stimulator of interferon genes，STING)与细菌信号分子环化双鸟苷酸(c-di-GMP)的相互作用关系，为理解固有免疫系统如何感应及防御微生物的感染提供了重要信息[61]。研究人员发现一种叫STING的跨膜蛋白能够直接感应一种叫c-di-GMP的信号分子，这种信号分子广泛存在于细菌中，是调控细菌浮游状态与定植状态之间转变的第二信使分子。这种信号系统是细菌所特有的，在高等真核生物中却没有被发现，因此，它可以作为高等生物识别“自我”和“非我”的重要靶点。

从现有的研究成果来看，可以作为病原体相关分子模式的化合物包括了脂类、糖类、蛋白质、多肽、RNA、DNA以及小分子代谢产物几乎所有类别的生物活性物质，但获得较多关注的也只是细菌的脂多糖、肽聚糖、膜蛋白和核酸成分这些含量较高的大分子化合物，而对细菌中存在的大量小分子代谢产物是否可作为PAMPs被机体识别的研究只有极少的报道。细菌在生长和繁殖过程中，其合成和代谢途径的中间和终产物数量庞大，而且在分子结构上与真核生物存在显著差异，前述两项研究已经证实了这些小分子化合物作为PAMPs的可能。抗生素也是细菌的代谢产物，目前尚不明确其机制的抗生素后效应是否也与固有免疫受体的激活有关，这些都需要进行深入的研究。

虽然模式识别受体的研究一直是近年来免疫学的前沿热点领域，但是天然免疫反应中这些PRRs识别病原体的种类、方式以及精确调控机制在宿主防御、炎症和疾病中的作用尚有许多悬而未决的问题需要进一步深入研究与探讨。如前所述，目前对PRRs的研究主要集中于TLRs家族，其多数家族成员的配体均已清楚。但从现有研究结果看，TLRs家族只有11(人)～13(小鼠)个成员，而NLRs家族已有至少23(人)～34(鼠)个成员，除NALP3被发现具有多种配体识别功能，其他如 NOD1、NOD2和NAIP5等的配体均为胞内感染细菌。NLRs作为一类重要的胞质型PRRs，在固有免疫中应具备更为广泛的生理和病理作用，但目前已知配体的仅有少数几个成员。

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[收稿2013-05-22 修回2013-06-13]

(编辑 许四平)

R392.11

A

1000-484X(2014)05-0694-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.029

①本文为国家自然科学基金青年基金项目(31101795，31101833)、现代农业技术领域863计划(2011AA100301)、现代农业产业技术体系(CARS-42-G03)及江苏省普通高校研究生科研创新计划项目(CXZZ13-0916)

②江苏省家禽科学研究所，扬州225125。

陶志云(1979年-)，女，在读博士，助理研究员，主要从事动物免疫学及动物遗传育种方面的研究，E-mail: zhiyun2@126.com。

及指导教师:秦爱建(1961年-)，男，博士，教授，主要从事预防兽医学、病原微生物生物学特性及其致病与免疫机理研究等方面的研究，E-mail:aijian@yzu.edu.cn。