膀胱癌干细胞标记物的研究进展

王海明 石爱平 许 宁

(吉林大学第一医院泌尿外科，吉林 长春 130021)

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，可以直接威胁患者的生存。在全球范围内，膀胱癌发病率排在恶性肿瘤的第11位，在我国，膀胱癌发病率低于西方国家，但近些年来的发病率有增高的趋势，严重威胁着患者的健康〔1〕。尽管当前在膀胱癌的治疗上有了很成熟的治疗方案，但对于其复发和转移仍无好的方法，人们一直在寻找治疗膀胱癌的新方法。10多年前，Reya 等〔2〕提出的肿瘤干细胞(CSCs)学说中提示肿瘤干细胞是维持肿瘤生长、复发以及转移的根源所在，为探索肿瘤治疗的新途径提供了依据。随着对干细胞研究的深入，干细胞在临床应用上的作用越来越受到重视。膀胱癌干细胞(BCSCs)是一类膀胱组织中具有多向分化潜能的特殊细胞，被认为是膀胱癌发生的启动细胞，可以诱发肿瘤的形成，BCSCs的研究在了解膀胱癌的发病机制及诊疗中发挥重要作用，可以为新的诊疗思路提供依据，而膀胱癌的特异性标志物是BCSCs研究的关键之一。不同组织来源的干细胞表达不同的标志物，但有些表面标志物却在不同的干细胞中均有表达。当前研究的CSCs分子标志物并不是特异性的标志物而仅仅是相关的标志物。目前国内外BCSCs标志物的研究较少，本文着重对用于BCSCs的标志物进行综述，以期进一步加深对BCSCs的认识，为膀胱癌新的诊疗方案提供帮助。

1 常用的BCSCs标志物

1.1细胞表面分子标志物 目前研究中常见的肿瘤分子标志物有CD44、CD47、CD20、CD5、CD133等，而CSCs表面标志物并不是特异性的标志物，而只是一些相关的标志物，如表面标志物CD44+/CD24-/low已证实是乳腺CSCs的标志物〔3〕，CD133+已证实是肺〔4〕和脑〔5〕等实体CSCs标志物，但这些表面标志物也可以是BCSCs表面标志物。

1.1.1CD44 CD44属于黏附分子家族的一员，是一种存在于细胞表面的跨膜糖蛋白，近年来的研究发现CD44有标准体(CD44S)与变异体(CD44V)两种，与肿瘤的生长和转移有密切关系。CD44分子有广泛的生物学功能，如细胞表面分子，参与细胞增殖、细胞分化及细胞迁移；参与细胞因子、趋化因子和生长因子等相应受体的表达以及重要的细胞信号转导。Wood ward等〔6〕已证实CD44是造血系统肿瘤、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤的CSCs相对特异性标志物。CD44是公认的细胞表面标志物，CD44+细胞位于正常尿道上皮及尿路上皮癌的基底层，几乎常规用于确认膀胱癌。Chan 等〔7〕基于CD44+、CK5+及CK20-分离和鉴定原发性膀胱癌启动细胞亚群，进一步证实此亚群细胞丰富的致瘤能力，可诱导裸鼠成瘤。另外，对300例膀胱癌患者CD44的表达分析显示，有约40%CD44+的亚群肿瘤细胞。CD44+细胞亚群诱导肿瘤的效力是表型相同异种移植模型的10～200倍，由此确认它们的肿瘤起始能力，证实了CD44+的高表达，具有高致瘤性，可作为BCSCs的分选标志物。Yang 等〔8〕通过磁性细胞分选和细胞培养方法证明：CSCs表达CD44的变异亚型(CD44v6)和上皮膜抗原(EMA-)，在膀胱癌组织中，EMA-CD44v6阳性细胞数约占癌症细胞的30%；体外细胞单克隆实验分析表明，这些细胞具有较高的自我更新能力与亲代肿瘤有相同的克隆能力。由此可以证明CD44v6+和EMA-的干细胞具有细胞集落形成、自我更新和增殖能力，所以认定CD44v6+和EMA-是BCSCs的表型，可能是BCSCs分选标志物。2013年Zhu等〔9〕利用MB49膀胱癌干细胞株(MCSCS)通过流式细胞(FACS)分析证明CD44+和CD133+高表达于MCSCS；利用定量PCR技术分析比较证实OCT4、CD44、CD133和NANOG高表达于MCSCS。因此，CD44可能作为MCSCS表面标记物之一。

1.1.2CD133 CD133又名prominin 1，是一种细胞表面黏附分子，是一种由5个跨膜结构域的N-糖基化的胞外环组成的跨膜糖蛋白，虽然其功能尚不清楚，但随着细胞的分化，CD133随之下调，所以常被应用于干细胞的分离鉴定。Pellacani 等〔10〕证实CD133可作为前列腺癌的干细胞标志物。Zhu等〔9〕利用MB49 MCSCS通过流式细胞(FACS)及定量PCR技术分析证明CD133+高表达于MCSCS。Bentivegna等〔11〕收集了49例膀胱癌电切组织样本，经染色后通过免疫荧光分析及细胞遗传学分析，分离出CD133高阳性表达的细胞，通过免疫组化及裸小鼠移植实验成功鉴定了此细胞为BCSCs。所以CD133也可以作为BCSCs的分选标志之一。

1.1.3CD47 CD47也称为整合素相关蛋白(IAP)，存在于细胞表面，属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，可对巨噬细胞的吞噬功能有抑制作用，CD47的表达与肿瘤免疫及预后相关，随着对其研究的深入，CD47将在肿瘤的治疗中发挥重要作用，有广阔的前景。Chan 等〔12〕利用CD47+/CD5+/CD20-分选出BCSCs，发现CD47在膀胱癌细胞中广泛表达，CD47在BCSCs的特异性增加并也显著表达，CD47可与巨噬细胞表面受体SIRPα结合，阻断巨噬细胞的吞噬，证明了CD47可能是膀胱癌治疗的靶点。因此，CD47可能作为一类BCSCs的分选标志物。

1.2乙醛脱氢酶1 乙醛脱氢酶(ALDH)是一系列氧化各式各样醛类转变为相应酸的酶。近年来的研究表明〔13〕人体细胞内的ALDH1可能在干细胞生物学方面发挥重要作用，已被用作一个标记，用来识别和分离干细胞或者癌干细胞。ALDH1A1是ALDH1家族的主要成员，Ginestier等〔14〕研究表明，ALDH1A1是乳腺CSCs的标记物，其表达与肿瘤的分期、分级和预后不良相关。Su等〔15〕利用ALDEFLUOR及流式细胞分选(FACS)从人膀胱癌细胞系中分离出ALDH1 A1+细胞，通过体外体内实验表明，ALDH1 A1+膀胱癌细胞与ALDH1 A1-癌细胞相比具有更高的致瘤性，ALDH1A1表达降低后，致瘤性也随之降低，ALDH1A1+膀胱癌细胞可在体内连续传代、移植，导致了异质细胞群，该ALDH1A1+膀胱癌细胞可以代表膀胱癌中的CSCs。另外，Su课题组还利用免疫组织化学(IHC)的方法对临床标本的分析发现，预后不良的患者与ALDH1A1的高表达有显著的关联，因此，ALDH1A1可能是膀胱CSCs相关的功能标志物，并可能是膀胱癌的恶性进展和预后不良的因素。近期，国内张海涛等〔16〕应用免疫组化的方法对非浸润性膀胱癌组织和癌旁正常膀胱组织的ALDH1的表达进行检测，发现在非浸润性膀胱癌组织中，ALDH1的表达高于正常膀胱组织，证实了其与非浸润性膀胱癌的病理分级、分期及肿瘤复发相关联。此外，新出现的证据表明，ALDH1不仅是一个标志物用于干细胞的标记，其也可以起到自我保护、分化和扩展功能的重要作用。

1.3细胞角蛋白 细胞角蛋白(CK)是一类主要骨架蛋白，存在于上皮细胞中的角质细胞中，当前已有20多种CK已得到了证实。CK的表达某种程度上反应了细胞分化，可作为一种常用的肿瘤免疫组织化学标记物。Chan 等〔7〕证实了CD44+细胞中不表达CK20，可以应用CD44+/CK5+/CK20-分离BCSCs。He等〔17〕证实可应用CK17+/CK18-/CK20-/CEAM6-来分离鉴定BCSCs。另外，Ck17是存在于尿路上皮基底细胞，有很强的成瘤能力，其在SW780细胞株具有较强的表达形成的肿瘤细胞，CK17+常联合67 kD层黏连蛋白受体(67LR)阳性的肿瘤细胞，而排斥的CD66C，通过检测67LR细胞基因表达，显示在Wnt信号传导相关基因高表达于67LR明亮的细胞，证明了67LR+/CEACAM6-/CK17+可以应用于分离鉴定BCSCs。目前的研究表明CK20、CK17、CK18、CK5和67LR等被认为可能是BCSCs相关的标志物。

1.4OCT-4 Oct-4也称为POU5F1基因，是一个关键的胚胎干细胞调控因子，能够自我更新和分化。OCT-4主要定位于肿瘤细胞的细胞核，OCT-4已被引入作为分子标记用于生殖细胞肿瘤。Atlasi 等〔18〕用免疫组化、半定量RT-PCR方法和Western印迹等方法确定了OCT-4几乎在全部检测的膀胱癌组织标本中表达，但是，低表达于癌旁组织及正常膀胱组织标本。Zhu等〔9〕利用定量PCR技术及Western印迹证明OCT-4在自我更新中发挥了显著作用，被确定为关键分子，在蛋白质水平和mRNA转录物水平维持自我更新和分化，OCT-4的大量表达表明OCT-4基因有可能导致肿瘤的发生，并与某些癌症的耐疗法或癌症复发密切相关。Bentivegna 等〔11〕从49例电切样本组织分选出OCT-4高表达的干性细胞，并证明了膀胱癌患者组织中存在CSCs样群体。所以，全能干细胞标志物OCT-4可作为BCSCs的标志物，它们的表达也与肿瘤的发生、复发或抗性的治疗方法密切相关。

1.5Nanog、Bmi-1 Nanog属于ANTP类NK家族基因，是一种具有自我更新的关键调节基因；BMI-1又称为干细胞更新因子，是一种自我更新的原癌基因。研究证实〔19〕Nanog和Bmi-1基因已被证明在某些类型的CSCs中发挥作用，表明这些调节基因的功能是CSCs自我更新和肿瘤发生的至关重要因素。王卫生等〔20〕通过检测人膀胱癌组织中Nanog调节因子的表达，证明干细胞标记基因Nanog在膀胱癌组织中少许表达，这些细胞可能是BCSCs，为BCSCs的分离鉴定提供了依据。Zhu等〔9〕证明Nanog是膀胱癌分化的关键分子，在蛋白质水平和mRNA转录物水平维持自我更新和分化，Nanog的大量表达表明其与肿瘤耐疗法及癌症的复发相关。Zhang等〔21〕选择表达Nanog和Bmi-1等干细胞基因的患者的膀胱癌组织，利用免疫组织化方法检测表明，Nanog和Bmi1的在膀胱癌中的高表达与病理高分级相关。高表达Nanog和Bmi-1的细胞可能代表了一类干细胞样的细胞群，可能作为肿瘤中的潜在的生物标志物，与预后相关联。

1.6ABCG2 ABCG2属于ABC超家族，是侧群(SP)细胞的特异性标志物，可用于SP细胞的分离鉴定，作为一个标记用于干细胞的研究。ABCG2是决定SP细胞分子表型的重要蛋白。Zhu等〔9〕利用MB49 MCSCS通过Western Blot证明ABCG2在MCSCS中大量表达。Hepburn等〔22〕对148例非浸润性膀胱癌样品中进行ABCG2表达的研究，结果表明ABCG2转运蛋白主要在SP侧群中表达和上调，SP细胞中ABCG2的表达为非SP细胞的3倍，ABCG2高表达的侧群可以作为干细胞的标记，在肿瘤集落形成效率上是ABCG2低表达的3倍；在体内，ABCG2 高表达的SP细胞肿瘤富集生长与CSCs是一致的。ABCG2可以作为一类干细胞标记，其高表达的SP细胞在人类非浸润性膀胱癌和MAPK / ERK信号通路中是一个可能的治疗靶点。

1.7MAGE-A3 1991年van der Bruggen等〔23〕首次分离出黑色素瘤抗原(MAGE)，根据在染色体分布的不同部位，将其分为A、B、C、D、E、F六个亚科，黑色素瘤抗原-A3(MAGE-A3)作为MAGE家族中的一员，多在黑色素瘤表达，在不同类型的肿瘤组织中也广泛表达，但罕见表达于正常的组织(除睾丸和胎盘细胞)。该抗原不但可被相应的MHC Ⅰ类分子呈递，并且能够被HLA Ⅱ类分子递呈给CD4+T或CD8+T细胞，可使机体产生针对表达MAGE-A3肿瘤的细胞免疫。目前研究报道〔24，25〕在肺癌、食道癌、原发性肝癌、头颈部鳞癌、结肠癌、鼻咽癌等恶性肿瘤中都阳性表达MAGE-A3。殷波等〔26〕利用RT-PCR技术、免疫荧光双标记技术及Western印迹技术测定MAGE-A3在BCSCs中的表达情况，检测了BCSCs的标志物CDl33在T24侧群细胞中的表达情况，及其与MAGE-A3的共表达情况，MAGE-A3和CDl33在T24侧群细胞中具有阳性共表达，并证实了这些侧群细胞为BCSCs。所以，MAGE-A3有望成为BCSCs一个新的特异性的标志物。

2 BCSCs标志物在膀胱癌的诊疗中的应用研究

目前针对膀胱癌患者的术后辅助治疗还是传统的放化疗及免疫治疗方法，由于治疗的盲目性及对药物的耐受，膀胱癌的复发和转移并没有得到根本的解决。最近，从各种人类恶性肿瘤分离出的CSCs的特点表明，CSCs耐受放化疗〔27〕，CSCs可能是复发转移的根源，同时也是干预治疗的理想靶点。Hepburn等〔22〕认为ABCG2可以将化疗药物代谢转运出细胞外，干扰化疗药物的疗效。Chan 等〔7〕研究发现CD47可与巨噬细胞表面受体SIRPα结合后，阻断巨噬细胞的吞噬功能，阻断CD47能够在体外增加巨噬细胞吞噬膀胱癌细胞的能力，用抗CD47单克隆抗体可阻断体内的转移，CD47有望成为膀胱癌治疗的新靶标。BCSCs标志物与膀胱癌的发病机制诊疗及预后密切相关，利用BCSCs的特异性标志物，探索一种选择性杀灭BCSCs的个体化诊疗方案并联合传统的治疗方案，将是一种膀胱癌治疗的新思路新方法。

综上所述，BCSCs标志物在膀胱癌的发病机制、抗复发疗法中发挥重要作用，尽管一些潜在的干性标志物在膀胱癌中已经确定，但并非特异性的标志物，这些标志物还经常在正常膀胱干细胞或祖细胞中检测到，因此，需要探索更特异的标志物或者联合多种标志物对BCSCs进行标记示踪，已实现针对CSCs的靶向治疗，为癌症复发、耐药的研究及开辟新的临床治疗领域提供更多理论依据。

3 参考文献

1那彦群.实用泌尿外科学〔M〕.北京：人民卫生出版社，2009：280-4.

2Reya T，Morrison SJ，Clarke MF，etal.Stem cells，cancer，and cancer stem cells〔J〕.Nature，2001;414(6859)：105-11.

3de Beça FF，Caetano P，Gerhard R，etal.Cancer stem cells markers CD44，CD24 and ALDH1 in breast cancer special histological types〔J〕.J Clin Pathol，2013;66(3)：187-91.

4Eramo A，Lotti F，Sette G，etal.Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population〔J〕.Cell Death Differ，2008;15(3)：504-14.

5Singh SK，Hawkins C，Clarke ID，etal.Identification of human brain tumour initiating cells〔J〕.Nature，2004;432(7015)：396-401.

6Woodward WA，Sulman EP.Cancer stem cells：markers or bio markers〔J〕?Cancer Metastasis Rev,2008；27 (3)：459-70.

7Chan KS，Espinosa I，Chao M，etal.Identification，molecular characterization，clinical prognosis，and therapeutic targeting of human bladder tumor-initiating cells〔J〕.Proc Nat Acad Sci USA，2009;106(33)：14016-21.

8Yang YM，Chang JW.Bladder cancer initiating cells (BCICs) are among EMA-CD44v6+ subset：novel methods for isolating undetermined cancer stem (initiating) cells〔J〕.Cancer Invest，2008;26(7)：725-33.

9Zhu Y，Lei C，Luo Y，etal.A modified method for isolation of bladder cancer stem cells from a MB49 murine cell line〔J〕.BMC Urol，2013;13(1)：57.

10Pellacani D，Oldridge EE，Collins AT，etal.Prominin-1 (CD133) Expression in the prostate and prostate cancer：a marker for quiescent stem cells〔J〕.Adv Exp Med Biol，2013;777(2):167-84.

11Bentivegna A，Conconi D，Panzeri E，etal.Biological heterogeneity of putative bladder cancer stem-like cell populations from human bladder transitional cell carcinoma samples〔J〕.Cancer Sci，2010;101(2)：416-24.

12Chan KS，Volkmer JP，Weissman I.Cancer stem cells in bladder cancer：a revisited and evolving concept〔J〕.Curr Opin Urol，2010;20(5)：393.

13Ma I，Allan AL.The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells〔J〕.Stem Cell Rev，2011;7(2)：292-306.

14Ginestier C，Hur MH，Charafe-Jauffret E，etal.ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome〔J〕.Cell Stem Cell，2007;1(5)：555-67.

15Su Y，Qiu Q，Zhang X，etal.Aldehyde Dehydrogenase 1 A1-positive cell population is enriched in tumor-initiating cells and associated with progression of bladder cancer〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2010;19(2)：327-37.

16张海涛，金美善，石爱平，等.肿瘤干细胞标记物ALDH1在非浸润性膀胱癌中的表达及其临床意义〔J〕.吉林大学学报：医学版，2013;39(2)：326-9.

17He X，Marchionni L，Hansel DE，etal.Differentiation of a highly tumorigenic basal cell compartment in urothelial carcinoma〔J〕.Stem Cells，2009;27(7)：1487-95.

18Atlasi Y，Mowla SJ，Ziaee SA，etal.OCT-4，an embryonic stem cell marker，is highly expressed in bladder cancer〔J〕.Int J Cancer，2007;120(7)：1598-602.

19Jiang L，Li J，Song L.Bmi-1，stem cells and cancer〔J〕.Acta Biochim Biophys Sin，2009;41(7)：527-34.

20王卫生，唐 伟.胚胎干细胞关键因子Nanog在膀胱癌中的表达及与肿瘤干细胞的关系〔J〕.重庆医科大学学报，2009;34(4)：409-11.

21Zhang Y，Wang Z，Yu J，etal.Cancer stem-like cells contribute to cisplatin resistance and progression in bladder cancer〔J〕.Cancer Lett，2012;322(1)：70-7.

22Hepburn AC，Veeratterapillay R，Williamson SC，etal.Side population in human non-muscle invasive bladder cancer enriches for cancer stem cells that are maintained by MAPK signalling〔J〕.PloS One，2012;7(11)：e50690.

23van der Bruggen P，Travesari C，Chomez P，etal.A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma〔J〕.Science，1991;254(5038)：1643-7.

24Li M，Yuan YH，Han Y，etal.Expression profile of cancer-testis genes in 121 human colorectal cancer tissue and adjacent normal tissue〔J〕.Clin Cancer Res，2005;11(5)：1809-14.

25贾正才，吴玉章.肿瘤抗原MAGE-A3研究进展〔J〕.免疫学杂志，2001;17(21)：S28-31.

26殷 波，石 武.MAGE-A3在人类膀胱癌干细胞中的表达〔J〕.现代肿瘤医学，2013;21(10)：2166-8.

27Li X，Lewis MT，Huang J，etal.Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy〔J〕.J Nati Cancer Inst，2008;100(9)：672-9.