五味子多糖诱导裸鼠胶质瘤细胞凋亡过程中Caspase-3的表达

唐泽波 温 娜 张 宇 刘兴吉 金 宏 齐 玲 于洪泉

(吉林医药学院后勤管理处，吉林 吉林 132013)

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，恶性程度高，约占颅内肿瘤的45%〔1〕。如何有效控制甚至治愈胶质瘤仍是亟待解决的难题。五味子多糖(CPSC)是从五味子成熟干燥果实中提取的含有五味子总多糖、17种以上氨基酸和16种以上微量元素的混合物，具有抗肿瘤活性〔2～8〕，但其具体的抗肿瘤作用机制尚不清楚。本课题组前期研究发现CPSC可以抑制胶质瘤细胞的生长〔9〕。本文进一步研究CPSC对体外培养裸鼠胶质瘤细胞诱导其凋亡的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1细胞和主要试剂 裸鼠胶质瘤细胞本实验室提取；五味子多糖(北华大学提供)；细胞培养基RPMI-1640(Thermo公司)，小牛血清和0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司)，半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗体(北京中杉公司)。

1.2提取原代裸鼠胶质瘤细胞 留取新鲜的裸鼠脑胶质瘤组织，用冷磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后将组织剪成碎块，置于10 ml离心管中，并加入木瓜蛋白酶放于37℃培养箱中消化30 min，吸取上清液，加血清终止消化，以300 r/min离心5 min后弃上清，加培养液反复吹打，过滤后以300 r/min速度离心5 min，离心弃上清，加入含10%血清培养液培养，台盼蓝计数活细胞，以2×106/75 cm2密度将细胞接种于培养瓶中，37℃、5%CO2及饱和湿度下培养12 h待用。

1.3ELISA法测定裸鼠胶质瘤细胞培养上清中Caspase-3蛋白表达 将裸鼠脑肿瘤细胞以1×106/ml密度接种于24孔培养板中，实验分为对照组(不含药物)和CPSC组(0、200、400、800 μg/ml)，作用48 h，每组设5个复孔。取细胞培养上清，将上清液与包被液按1∶1比例包被后4℃过液。封闭后加入Caspase-3抗体(1∶500稀释)于4℃过夜。加入二抗(1∶1 000稀释)室温下孵育2 h，加显色液室温避光显色。于自动酶标仪492 nm处测定A值。

1.4细胞免疫组织化学法检测Caspase-3蛋白在裸鼠胶质瘤细胞的阳性表达率 按上述方法和分组用不同剂量CPSC作用细胞48 h后，吸出培养上清，取出玻片，10%甲醛溶液固定30 min，空气干燥；灭活内源性过氧化物酶；一抗过夜，二抗室温孵育2 h，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。镜下观察，以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性着色，按照公式计算Caspase-3蛋白表达阳性率。

1.5统计学方法 应用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1CPSC对体外培养裸鼠胶质瘤细胞上清中Caspase-3蛋白表达水平 不同浓度(0、200、400、800 μg/ml)CPSC作用裸鼠胶质瘤细胞48 h后，其培养上清中Caspase-3蛋白表达水平均升高(0.79±0.02、0.86±0.01、0.91±0.01)，与对照组(0.71±0.01)比较有统计学意义(P<0.01)。

2.2细胞免疫组织化学法检测各组裸鼠胶质瘤细胞Caspase-3阳性表达率 CPSC作用裸鼠胶质瘤细胞48 h后，与对照组(26.42%±6.06%)比较，200、400和800 μg/ml多糖组Caspase-3表达阳性率(44.78%±6.58%、58.98%±3.32%、73.33%±5.12%)均明显升高(P<0.01)。

3 讨 论

脑胶质瘤目前治疗方案仍然是手术切除辅以放疗和化疗等综合治疗为主。诱导或促进肿瘤细胞凋亡是冶疗肿瘤的基本方法之一。

细胞凋亡是级联式基因表达的结果，可以通过多种形式诱导凋亡发生。在细胞凋亡的机制研究中提出了两条主要信号途径，线粒体途径和死亡受体途径〔9〕。Caspases是凋亡信号转导的共同通路，许多调控细胞凋亡的因素都通过Caspases酶系起作用，其中Caspases-3是该家族中最关键的效应分子，负责对凋亡途径最后执行阶段的全部或部分关键性蛋白的酶切，被称为凋亡的执行者〔6〕。当细胞接受凋亡信息时，经过一系列反应激活Caspases-3，活化的Caspases-3通过激活、破坏某些酶，或破坏细胞骨架蛋白等方式，最终导致特征性DNA断裂，从而介导肿瘤细胞发生凋亡。CPSC是否能通过激活Caspases-3而实现抗胶质瘤作用目前报道不多。本研究结果说明CPSC可能是通过上调Caspase-3蛋白激活了线粒体信号传导路径，引起细胞凋亡，从而使裸鼠胶质瘤细胞发生凋亡。

4 参考文献

1师 蔚，郭振宇.脑胶质瘤发病机制、诊断与治疗的研究进展〔J〕.中华神经医学杂志,2007；6(9):869-71.

2黄 玲，陈 玲，陈振林.五味子多糖对荷瘤鼠瘤体抑制作用的病理学观察〔J〕.中药材，2004；27(3):202-3.

3王艳杰，吴勃岩，孙 阳，等.五味子多糖对H22、S180荷瘤小鼠抑制作用的实验研究〔J〕.中医药信息，2007；24(5):64-5.

4于 赫，李 冀，齐 彦.五味子多糖对肝癌小鼠肿瘤生长的抑制作用及其免疫学机理初探〔J〕.中医药信息,2010；27(2):26-7.

5许珂玉，肖建英.五味子多糖对甲状腺癌细胞株SW579凋亡及survivin表达的影响〔J〕.吉林大学学报(医学版)，2011；37(2):279-83.

6甘 露.五味子多糖对肝癌小鼠肿瘤生长及免疫功能的调节作用〔J〕.免疫学杂志,2013；10(29):867-70.

7Hengartner MO.The biochemistry of apoptosis〔J〕.Nature,2000;407(12):770-6.

8Movsesyan VA,Stoica BA,Yakovlev AG,etal.Anandamide induced cell death in primary neuronal cultures role of calpain and caspase pathways[J].Cell Death Differ,2004；11(10):1121-32.

9温 娜，唐泽波，袁 瑞，等.五味子粗多糖对脑胶质瘤细胞生长的作用〔J〕.中国老年学杂志，2013；32(12)：2837-8.