G蛋白偶联雌激素受体在雌激素相关肿瘤发生中的作用

赵丕文，David Yue-Wei Lee，陶仕英，陈 梦，牛建昭

［1.北京中医药大学基础医学院，北京 100029;2.Mclean Hospital(Harvard Medical School)，Belmont，MA 02478］

雌激素调控相关基因表达的效应早已为大家所熟知，而且其调节功能是通过靶细胞特异性的细胞核受体——雌激素受体(estrogen receptor，ER)实现的［1］。经典的雌激素受体具有两种亚型，即ERα和ERβ。其中，第1个雌激素受体ERα 是 Green和 Greene等［2－3］在1986年克隆得到的。1996年，Kuiper等［4］又从大鼠卵巢和前列腺cDNA文库中克隆出雌激素受体第二种亚型——ERβ。但近年来的多项实验研究发现，雌激素亦有与转录调节功能无关的快速细胞信号转导途径［5－7］。上述两种经典的雌激素受体亚型介导机制无法确切地阐明其作用途径。同时，虽然经典ER，特别是ERα在雌激素相关肿瘤如乳腺癌发生中起着重要作用［8－9］，但治疗中遇到的组织选择性或特异性问题，以及在某些治疗中存在的抗药性问题，使治疗有效率仅为50% ～80%。所以，也迫切需要寻找更好的作用靶点和更广泛而有效的治疗策略来抑制乳腺癌细胞中的雌激素信号转导体系。

1998 年，O’Dowd等［10］发现并证明了 ERα 和 ERβ 之外的第3种雌激素受体——膜G蛋白偶联受体30(G-proteincoupled receptor 30，GPR30)的存在。此后不久，该受体相继被多个实验室在多项研究中发现并确认［11－12］，而且因其对雌激素及雌激素样物质的特异性结合，及其对雌激素效应基因表达的调节功能，GPR30之后被给予了另一个名称——G蛋白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor，GPER)［13］，该受体效应的揭示为诠释上述雌激素的快速应答反应提供了重要依据和切入点。多种能够结合经典雌激素受体的化合物被证明也可结合、活化GPER［14］。经典雌激素受体阴性细胞如SKBR3细胞也可经GPR30介导雌激素的应答反应［7］。多项研究已经表明，GPER参与了多种生命活动的调节、控制过程，例如与能量平衡、脂代谢［15］、心血管功能［16］、神经记忆调节［17］等均有密切关系;特别是在多种雌激素相关肿瘤的发生及演变中，GPER发挥了重要的介导作用［18］。随着对GPER的深入研究和认识，经典雌激素受体一直是雌激素样或抗雌激素样物质发挥效应核心靶点的概念必须加以扩展，GPER也成为了特异性雌激素相关肿瘤细胞抗肿瘤药物的候选新靶标。以下将就GPER与肿瘤，特别是妇科肿瘤发生关系的有关进展和研究成果进行综述。

1 与妇科肿瘤的关系

乳腺癌是临床妇科常见肿瘤，干扰或抑制细胞中的雌激素信号转导体系一直是有关药物发挥疗效的重要分子机制。Filardo等［19］发现，在乳腺癌细胞GPER有过量表达，且表达量与肿瘤大小成正比。细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)在乳腺癌细胞中的快速活化依赖于GPER的存在。无论在几乎不表达GPER的MDA-MB-231细胞，或者在同时表达ERα和GPER的MCF-7细胞，外源性诱导GPER的表达均可导致胞内雌激素依赖性ERK1/2的磷酸化。而在表达GPER、不表达ERα的SKBR3乳腺癌细胞，亦可见雌激素诱导的ERK1/2磷酸化［20］。其后的研究又发现，虽有作用靶标的相似性，通过GPER介导对不同类型乳腺癌细胞增殖活性的影响趋势却不尽相同。Ariazi等［13］实验证明了GPER可以与17β-雌二醇结合，并调节雌二醇诱导的非基因信号途径，并应用ERα阳性乳腺癌细胞对这一作用的机制进行了研究。应用选择性激活GPER与ER的GPER协同剂G-1和己烯雌酚分别刺激MCF-7细胞和SKBR3细胞，发现GPER可介导并促进SKBR3细胞增殖，同时可减弱MCF-7细胞增殖，并将其细胞周期阻抑在G1期。因此，GPER可以拮抗ERα阳性乳腺癌细胞的增殖活性，为应对该类疾病提供了一种新的治疗靶标。

组织缺氧是实体瘤细胞在细胞凋亡、生存、增殖等功能活动中的共同特征。肿瘤细胞对缺氧环境的反应主要受核低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的介导。Recchia等［21］证明，由缺氧引起的HIF-1α因子表达也将可进一步上调GPER水平并活化其下游靶因子——结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)在ER阴性乳腺癌SKBR3细胞中的表达。进一步研究还发现，位于GPER启动子位置的HIF-1α反应元件通过活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)诱导的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)/ERK信号通路参与了缺氧引发的GPER转录激活效应。而且，缺氧引发SKBR3细胞凋亡的效应可以被雌激素阻断，该阻断效应是通过GPER途径发挥的。所以，缺氧导致GPER表达参与了雌激素诱导的抗凋亡效应，特别是在低氧环境中。

最早被人们认识的孤儿受体——雌激素相关受体(estrogen related receptor，ERR)的发现，为解释多种雌激素相关效应提供了新的思路。基于ERRs不同亚型(α、β和γ)均与ERα有很高的序列一致性，所以，虽然它们不与雌激素相结合，但在其它生化活性方面与ER共享，包括与雌激素应答元件(estrogen response element，ERE)的结合［22－23］;而其后的研究发现，GPER不仅影响着ER相关转导通路的效应，也参与ERR相关转导通路的介导和调节功能。研究表明，在某些组织和细胞株中，17β-雌二醇可以调节ERRα的表达，并通过ERα实现。但在ERα和ERβ阴性乳腺癌SKBR3细胞中，17β-雌二醇也可以刺激 ERRα 的表达。Li等［24］发现，雌二醇、ERα协同剂和拮抗剂、选择性ER调节剂他莫昔芬(tamoxifen，TAM)均可对ERRα基因或蛋白及其下游相关基因表达产生影响。进一步研究发现，上述效应均受到GPER的介导调节。应用其特异性拮抗剂，Li等还证明了一条可经ER协同剂和激动剂触发的通过GPER调节的不同的下游转导通路，即应用雌二醇或雌激素受体拮抗剂均可诱导ERRα启动子区域核小体差异性的组蛋白乙酰化及转录因子募集效应。这些发现为明确GPER/ERRα调节的信号通路的分子机制、揭示乳腺癌细胞对TAM诱导的抑制效应的逃逸机制提供了实验依据。

Wang等［25］在应用GPER协同剂G-1和拮抗剂G-15观察卵巢粒层癌KGN细胞增殖、凋亡效应的过程中，发现G-1可以抑制KGN细胞增殖并诱导其凋亡过程，而应用G-15或诱导GPER基因沉默将可阻抑上述效应。尤其值得注意的是，G-1对ER阴性乳腺癌MDA-MB 231细胞也具有增殖抑制作用。总的来看，G-1对卵巢癌、乳腺癌依赖于GPER的增殖抑制作用，使其可能成为卵巢癌和乳腺癌药物研发中的重要候选者。Ignatov等［26］的研究也发现，GPER可以作为一种新型的癌症抑制剂，其对卵巢癌具有明确的临床疗效，有着非常值得期待的临床应用前景。已有的临床检测结果已表明，在良性、低转移率卵巢癌患者中GPER-1表达明显较低;卵巢癌患者的两年存活率在GPER阴性和阳性组有明显的差异:GPER阴性患者存活率为28.6%，而阳性组为59.2%。在GPER阳性SKOV-3和OVCAR-3卵巢癌细胞中，选择性GPER协同剂G-1可通过上调cyclinB1、Cdc2表达，增强组蛋白3磷酸化作用抑制细胞周期进入G2/M期，并刺激caspase依赖性的细胞凋亡过程而发挥抗癌效应。此外，临床研究还发现，GPR30与EGFR的共表达与卵巢癌疗效成负相关、预后较差;实验结果显示，EGFR和Akt的磷酸化作用可以被GPER协同剂G-1所抑制，GPR30可通过EGFR途径促进Akt的磷酸化过程［27］。该研究也再次证明了对细胞内GPR30表达的调控在卵巢癌治疗中将具有非常有潜力的应用前景。

临床实践已表明，雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulator，SERM)TAM作为ER拮抗剂广泛应用于临床乳腺癌治疗，但在长期应用后将引起子宫内膜癌发病风险的增加［28－29］。为了探索其可能机制，Vivacqua等研究发现，TAM的活性代谢产物4-hydroxytamoxifen(OHT)可以经不依赖于ERα的快速应答通路，即GPR30途径上调子宫内膜癌Ishikawa和HEC1A细胞的c-fos表达;促进两种细胞的增殖。而拮抗GPR30的作用或干预MAPK通路的转导将导致OHT促增殖作用的消失。该结果为药物的临床应用，特别是减少其副作用提供了重要的参考和依据。为了进一步证明GPER在子宫内膜癌发生中的作用，Smith等［30］实验发现，癌细胞中有GPER过量表达，而且表达量与癌症的严重程度呈正相关，患者的生存率也随着GPER的超量表达明显降低。实验结果为子宫内膜癌的临床治疗提供了新的思路，具有重要的理论和临床意义。

近年来，针对源自植物的植物雌激素，即存在于一些植物中、具有雌激素效能的天然化合物的研究也日益引起了人们的关注，其对雌激素相关肿瘤细胞内的雌激素信号转导网络体系也具有重要的调节作用;植物雌激素也可通过影响雌激素相关信号转导通路影响肿瘤细胞的增殖［31－32］。作为一种异黄酮类植物雌激素，金雀黄素可以通过雌激素受体，特别是ERβ途径，对雌激素依赖性乳腺癌MCF-7细胞发挥剂量依赖性的促进或抑制作用;Maggiolini和 Thomas等［33－34］研究发现，金雀黄素对GPER也具有强亲和力，并可经GPER途径发挥胞内效应。Lucki等［35］进一步的实验也发现一定浓度的金雀黄素可以通过GPER依赖途径促进MCF-7细胞ERK1/2的表达，进一步诱导ASAH1和cyclinB2的表达，并以ASAH1依赖性方式促进细胞增殖，这也为金雀黄素可以增加鞘脂类代谢提供了一个重要机制，并为ASAH1在乳腺癌细胞生长中的作用提供了实验依据。在某些雌激素敏感肿瘤中，Atrazine被发现可不通过结合、活化ER而上调芳香化酶活性。Albanito等［36］实验进一步发现，Atrazine不能刺激内源性ERα的表达和芳香化酶的活化，但可以诱导ERK磷酸化和雌激素靶基因的表达;利用特异性信号抑制剂和基因沉默方法，发现并证明了Atrazine刺激卵巢癌细胞增殖、产生雌激素样效应是通过GPER-EGFR途径实现的。

综上所述，我们不难看出，在乳腺癌等多种妇科肿瘤发生之初或发展进程中，如果应用适当的选择性雌激素受体调节剂，并能够同时靶向GPER和ER亚型(特别是ERα)，将对肿瘤的治疗效果有非常重要的保证［37］。

2 与男性生殖系统肿瘤的关系

睾丸生殖细胞癌是年轻男性的常见肿瘤，近年来在世界范围内的发病人数日益增加。临床研究表明，暴露于环境中具有雌激素样作用的内分泌干扰剂参与了睾丸癌症的形成。而深入研究发现，这些内分泌干扰剂对经典核雌激素受体作用较弱，其效应不仅在妇科常见肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌，而且在原发或迁移的睾丸生殖细胞癌中都是经过非经典的膜受体GPER介导、以非基因快速信号转导方式实现的。GPER在正常及癌变睾丸细胞中均有表达:睾丸精原细胞、精母细胞、足细胞均为GPER阳性细胞，睾丸精原细胞瘤、间质细胞瘤、支持细胞瘤也均为GPER阳性细胞［38－39］。深入研究发现，在睾丸生殖细胞肿瘤中最常见的精原细胞瘤中，膜GPER有过量表达并介导了其过度增殖效应，该效应可以被GPER选择性抑制剂G-15完全拮抗。与经典ER相比，在评价外源性雌激素或其他相关内分泌干扰剂对精原细胞癌效应的过程中，GPER应被给予更多关注;GPER可能将成为精原细胞癌治疗中的新靶点。

另有研究发现，GPER可以诱导前列腺癌细胞的生长抑制。Chan等［40］利用基因沉默或使用GPER协同剂G-1，发现GPER的激活可以维持ERK1/2的活化及c-jun/c-fos依赖性的p21上调，减少G2检验点调节因子cyclin A2、cyclin B1、cdc25c和cdc2等的表达及其共同的转录调节因子NFYA的磷酸化，从而诱导前列腺癌PC-3细胞的周期阻滞于G2期，实现对前列腺癌细胞生长的抑制效应。

3 与其他器官肿瘤的关系

Siegfried等［41］发现，在肺癌细胞中GPER也有高表达，将与ER一起参与介导肺癌细胞对雌激素或雌激素样物质的应答过程。运用GPER抑制剂抑制GPER依赖性信号转导途径，可以成为靶向雌激素信号转导通路的肺癌治疗策略。

针对甲状腺癌的调控机制，Vivacqua等［42］实验研究了雌二醇、金雀黄素、OHT对TC细胞增殖的影响。结果表明，上述成分对TC细胞具有增殖促进效应，而且GPER及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信号通路介导了上述效应。因为该促增殖效应可以被GPER沉默或应用丝裂原活化蛋白激酶的激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)抑制剂所阻断。研究为揭示甲状腺癌发生的分子机制提供了新的思路和突破点［42］。

4 结语

与介导雌激素及雌激素样物质在体内发挥效应的经典核受体ERα和ERβ相比，GPER在体内也兼具分布的广泛性和介导效应的特异性。在对GPER分布、效应及其作用机制进行深入探索分析的基础上，同时靶向肿瘤细胞ER及GPER的药物，或根据特异性肿瘤细胞类型应用靶向性更加明确的抗肿瘤药物，将可以更有针对性地抑制肿瘤细胞增殖，更好地发挥抗肿瘤临床疗效。

［1］Edwards D P.Regulation of signal transduction pathways by estrogen and progesterone［J］.Annu Rev Physiol，2005，67:335 －76.

［2］Green S，Walter P，Kumar V，et al.Human oestrogen receptor cDNA:sequence，expression and homology to v-erb-A［J］.Nature，1986，320(6058):134 －9.

［3］Greene G L，Gilna P，Waterfield M，et al.Sequence and expression of human estrogen receptor complementary DNA［J］.Science，1986，231(4742):1150 －4.

［4］Kuiper G G，Enmark E，Pelto-Huikko M，et al.Cloning of a novel receptor expressed in rat prostate and ovary［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(12):5925 －30.

［5］Moriarty K，Kim K H，Bender J R.Minireview:estrogen receptor-mediated rapid signaling［J］.Endocrinology，2006，147(12):5557－63.

［6］Byer S J，Eckert J M，Brossier N M，et al.Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner［J］.Neuro Oncol，2011，13(1):28－41.

［7］Revankar C M，Cimino D F，Sklar L A，et al.A transmembrane intracellular estrogen receptor mediates rapid cell signaling［J］.Science，2005，307(5715):1625 －30.

［8］Ariazi E A，Kraus R J，Farrell M L，et al.Estrogen-related receptor alpha1 transcriptional activities are regulated in part via the ErbB2/HER2 signaling pathway［J］.Mol Cancer Res，2007，5(1):71－85.

［9］赵丕文，牛建昭，王继峰，等.丹参酮ⅡA抗乳腺癌细胞增殖作用研究［J］.中国药理学通报，2010，26(7):903－6.

［9］Zhao P W，Niu J Z，Wang J F，et al.Research on the inhibitory effect of Tanshinone ⅡA on brea st cancer cell proliferation［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(7):903 －6.

［10］O’Dowd B F，Nguyen T，Marchese A，et al.Discovery of three novel G-protein-coupled receptor genes［J］.Genomics，1998，47(2):310－3.

［11］Carmeci C，Thompson D A，Ring H Z，et al.Identification of a gene(GPR30)with homology to the G-protein-coupled receptor superfamily associated with estrogen receptor expression in breast cancer［J］.Genomics，1997，45(3):607 － 17.

［12］Takada Y，Kato C，Kondo S，et al.Cloning of cDNAs encoding G protein-coupled receptor expressed in human endothelial cells exposed to fluid shear stress［J］.Biochem Biophys Res Commun，1997，240(3):737 －41.

［13］Ariazi E A，Brailoiu E，Yerrum S，et al.The G Protein-coupled receptor GPR30 inhibits proliferation of estrogen receptor-positive breast cancer cells［J］.Cancer Res，2010，70(3):1184 －94.

［14］Prossnitz E R，Barton M.Signaling，physiological functions and clinical relevance of the G protein-coupled estrogen receptor GPER［J］.Prostaglandins Other Lipid Mediat，2009，89(3 －4):89 －97.

［15］Shi H，Kumar S P，Liu X.G protein-coupled estrogen receptor in energy homeostasis and obesity pathogenesis［J］.Prog Mol Biol Transl Sci，2013，114:193 －250.

［16］Reslan O M，Khalil R A.Vascular effects of estrogenic menopausal hormone therapy［J］.Rev Recent Clin Trials，2012，7(1):47 －70.

［17］Alonso A，González-Pardo H，Garrido P，et al.Acute effects of 17β-estradiol and genistein on insulin sensitivity and spatial memory in aged ovariectomized female rats［J］.Age(Dordr)，2010，32(4):421－34.

［18］Prossnitz E R，Sklar L A，Oprea T I，Arterburn J B.GPR30:a novel therapeutic target in estrogen-related disease［J］.Trends Pharmacol Sci，2008，29(3):116 －23.

［19］Filardo E J，Graeber C T，Quinn J A，et al.Distribution of GPR30，a seven membrane-spanning estrogen receptor，in primary breast cancer and its association with clinico-pathologic determinants of tumor progression［J］.Clin Cancer Res，2006，12(21):6359－66.

［20］Filardo E J，Quinn J A，Bland K I，Frackelton A R Jr.Estrogeninduced activation of Erk-1 and Erk-2 requires the G protein-coupled receptor homolog，GPR30，and occurs via trans-activation of the epidermal growth factor receptor through release of HB-EGF［J］.Mol Endocrinol，2000，14(10):1649 － 60.

［21］Recchia A G，Francesco E M D，Vivacqua A，et al.The G protein-coupled receptor 30 is up-regulated by hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α)in breast cancer cells and cardiomyocytes［J］.J Biol Chem，2011，286(12):10773 －82.

［22］Cheung C P，Yu S，Wong K B，et al.Expression and functional study of estrogen receptor-related receptors in human prostatic cells and tissues［J］.J Clin Endocrinol Met，2005，90(3):1830 － 44.

［23］Gaillard S，Dwyer M A，McDonnell D P.Definition of the molecular basis for estrogen receptor-related receptor-alpha-cofactor interactions［J］.Mol Endocrinol，2007，21(1):62 － 76.

［24］Li Y，Birnbaumer L，Teng C T.Regulation of ERRα gene expression by estrogen receptor agonists and antagonists in SKBR3 breast cancer cells:differential molecular mechanisms mediated by G protein-coupled receptor GPR30/GPER-1［J］.Mol Endocrinol，2010，24(5):969 －80.

［25］Wang C，Lv X，Jiang C，Davis J S.The putative G-protein coupled estrogen receptor agonist G-1 suppresses proliferation of ovarian and breast cancer cells in a GPER-independent manner［J］.Am J Transl Res，2012，4(4):390 －402.

［26］Ignatov T，Modl S，Thulig M，et al.GPER-1 acts as a tumor suppressor in ovarian cancer［J］.J Ovarian Res，2013，6(1):51.

［27］Fujiwara S，Terai Y，Kawaguchi H，et al.GPR30 regulates the EGFR-Akt cascade and predicts lower survival in patients with ovarian cancer［J］.J Ovarian Res，2012，5(1):35.

［28］Vivacqua A，Bonofiglio D，Recchia A G，et al.The G protein-coupled receptor GPR30 mediates the proliferative effects induced by 17beta-estradiol and hydroxytamoxifen in endometrial cancer cells［J］.Mol Endocrinol，2006，20(3):631 －46.

［29］Du G Q，Zhou L，Chen X Y，et al.The G protein-coupled receptor GPR30 mediates the proliferative and invasive effects induced by hydroxytamoxifen in endometrial cancer cells［J］.Biochem BiophysRes Commun，2012，420(2):343 －9.

［30］Smith H O，Leslie K K，Singh M，et al.GPR30:a novel indicator of poor survival for endometrial carcinoma［J］.Am J Obstet Gynecol，2007，196(386):e381 －9.

［31］赵丕文，牛建昭，王继峰，等.异补骨脂素的植物雌激素作用及其机制的探讨［J］.中国药理学通报，2009，25(9):1193－7.

［31］Zhao P W，Niu J Z，Wang J F，et al.Research on the phytoestrogen ic effect and its mechan ism of isopsoralen in T47D cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(9):1193 －7.

［32］赵丕文，牛建昭，王继峰，等.补骨脂素的植物雌激素作用及其机制探讨［J］.中国中药杂志，2008，33(1):59－63.

［32］Zhao P W，Niu J Z，Wang J F，et al.Research on phytoestrogenic effects and its mechanism of psoralen［J］.Chin J Chin Mat Med，2008，33(1):59 －63.

［33］Maggiolini M，Vivacqua A，Fasanella G，et al.The G proteincoupled receptor GPR30 mediates c-fos up-regulation by 17betaestradiol toestrogens in breast cancer cells［J］.J Biol Chem，2004，279(26):27008 －16.

［34］Thomas P，Dong J.Binding and activation of the seven-transmembrane estrogen receptor GPR30 by environmental estrogens:a potential novel mechanism of endocrine disruption［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，2006，102(1 －5):175 －9.

［35］Lucki N C，Sewer M B.Genistein stimulates MCF-7 breast cancer cell growth by inducing acid ceramidase(ASAH1)gene expression［J］.J Biol Chem，2011，286(22):19399 －409.

［36］Albanito L，Lappano R，Madeo A，et al.G-protein-coupled receptor 30 and estrogen receptor are involved in the proliferative effects induced by atrazine in ovarian cancer cells［J］.Environ Health Perspect，2008，116(12):1648 －55.

［37］Lappano R，Santolla M F，Pupo M，et al.MIBE acts as antagonist ligand of both estrogen receptor α and GPER in breast cancer cells［J］.Breast Cancer Res，2012，14(1):R12.

［38］Rago V，Romeo F，Giordano F，et al.Identification of the estrogen receptor GPER in neoplastic and non-neoplastic human testes［J］.Reprod Biol Endocrinol，2011，9:135.

［39］Chevalier N，Vega A，Bouskine A，et al.GPR30，the non classical membrane G protein related estrogen receptor(GPER)，is overexpressed in human seminoma and promotes seminoma cell proliferation［J］.PLoS One，2012，7(4):e34672.

［40］Chan Q K，Lam H M，Ng C F，et al.Activation of GPR30 inhibits growth of prostate cancer cells via sustained activation of Erk1/2，c-jun/c-fos-dependent upregulation of p21，and induction of G2 cell-cycle arrest［J］.Cell Death Differ，2010，17(9):1511 － 23.

［41］Siegfried J M，Hershberger P A，Stabile L P.Estrogen receptor signaling in lung cancer［J］.Semin Oncol，2009，36(6):524 －31.

［42］Vivacqua A，Bonofiglio D，Albanito L，et al.17beta-estradiol，genistein，and 4-hydroxytamoxifen induce the proliferation of thyroid cancer cells through the g protein-coupled receptor GPR30［J］.Mol Pharmacol，2006，70(4):1414 －23.