浅析影响血凝和血凝抑制实验的原因

许建华 赵 辉 贺 薪

(江苏省睢宁县林牧渔业局，江苏徐州 221200)

血凝和血凝抑制试验是兽医实验室检测鸡新城疫、禽流感免疫后抗体的常用方法之一。它也是检查防疫质量的重要依据。但在实验操作中，经常受到各种因素的影响，带来试验结果误差。

1 被检样品

1.1 采样

(1)随机采集的被检样本要能够代表整个鸡群。一般条件下，同一批次的抽检比例为1%～5%，养殖数量少于1 000只的，最少采集30个样本检测，采样数量过少，检测的结果不能代表鸡群的整体情况。日龄不同、免疫时间不同的样品，应该分开编号，不能混编。

(2)采样后要及时送检，不能及时送检的应按照要求进行预处理，分离的血清不能存放时间过久，否则会降低抗体效价。

1.2 被检血清

采完血样后，应将采血器向后回抽2～3 ml，留出空隙倾斜30°～45°角放置，让其自然析出血清(夏天放在室内，冬天可以放置在37℃温室内析出)。如果采血后马上离心，由于血液中蛋白，含量不同，含量偏高的血清不易分离，有的易形成胶冻状或不完全胶冻样，这样的血清抗体含量不均匀，检测的结果偏差大。分离好的血清若在1周内即可检验，可放在4 ℃冰箱内保存；如果短时间内不能检测，应放在-20℃～-80℃冰箱内保存，运送血清时应将血清放在盛有冰块的保温设备中运送。被检血清应避免反复冻融，反复冻融的血清抗体效价会降低。血清保存不当，腐败变质会严重影响试验结果。

2 反应板

(1)反应板应选择一次性使用96孔V型板，要保持板面及凹孔的干净，板面应水平，不能弯曲、倾斜，使用不合格的反应板会严重影响结果。板孔倾斜的角度会影响红细胞的沉降速度，角度过小，红细胞沉降加快，血凝价偏低，血凝抑制价偏高。角度过大，红细胞沉降减慢，血凝价偏高，血凝抑制价偏低。重复使用的微量反应板应保持干净，其清洁度对试验结果有很大的影响。当反应板中残留红血球时，测定的血凝效价偏低，血凝抑制效价偏高。反应板使用后应立即置水龙头下冲净血球(压力大的水龙头最好)，再用含有洗涤剂的温水溶液浸泡30 min，并在洗涤剂溶液中以棉拭子刷洗凹孔及板面，再用清水将洗涤液冲洗干净，放到浓度为2%～3%的盐酸溶液中浸泡24 h以上，取出用清水冲洗多次，最后，以蒸馏水冲洗2～3次，在37 ℃温箱中烘干备用。使用前检查血凝板，将其正对日光灯，孔底光洁透明无可见沉淀附着物为准。

(2)在试验静置过程中不能振动反应板。当反应时间没到而频繁的取放、观察反应板，操作不甚，凝集会受到影响，测定的凝集价偏低，而凝集抑制价会偏高。因此，在静置过程中一定要轻拿轻放，最好是等到时间再看结果，才能保证实验的准确性。

3 抗原效价的测定及配制

3.1 抗原的保存

鸡新城疫血凝及血凝抑制试验用的抗原一般有液体和干粉两种，应—20 ℃保存。在进行抗原效价的测定时，同一种抗原最好两瓶以上混合后使用，并做重复试验，取其平均值，减少误差。抗原的凝集价在外界不稳定，冷藏保存或反复冻融时其血凝价降低。测定好血凝价的抗原如果一次不能用完时应分装到灭菌离心管内，管上标注分装日期和效价，每管的分装量最好是一次使用量，避免反复冻融。使用反复冻融的抗原，血凝抑制滴度会偏高，一般血凝价相差的滴度与血凝抑制价相差的滴度相一致。

3.2 稀释液

稀释液应使用PH为7.0～7.2的PBS缓冲液，PBS液的pH在5.8以下，红细胞易自凝；试验结果不成立；pH7.8以上凝集的红细胞洗脱加快，使得凝集价检测偏低，凝集抑制价偏高。PBS液要现配现用，如果用生理盐水代替PBS液，要使用新开瓶的灭菌生理盐水，稀释液的配制时间不易过长，否则，可能被环境污染，不能保持无菌的反应环境，使得检测结果受到干扰，出现试验不成立、跳孔等现象。

4 加样

病毒悬液和红细胞悬液在使用前一定要摇匀，以保证每一孔中加入的浓度准确一致，避免加入的浓度高低不一，人为造成误差。摇晃红细胞悬液时力度不宜过大，防止红细胞的结构被破坏，造成溶血。

加液体时，避免吸头与反应板孔接触造成污染。尤其是在最后加入红细胞悬液时，孔内已有稀释液、血清、单位抗原等，如果吸头接触到孔内混合液，会造成各个孔内液体相互污染，导致试验结果出现误差。所以，在使用移液器时，一定要保持加样器吸头与凝集板孔间的距离，以保证每个凝集孔内液体数量和浓度准确。

稀释血清时，在吸取第一孔时要先按下移液器，再插入反应板孔内，吸取后插入第二孔液面以下，在反复抽取过程中，移液器吸头不要离开液面，防止产生气泡，造成移液体积不准确。

5 温度和时间

温度通常应在20℃～25℃，不能过高或过低，室温不适宜的应置于恒温箱内。温度高于37 ℃时，凝集的红细胞易洗脱，红细胞很快沉降下来，导致试验不成立，低于20 ℃反应速度减慢，在规定时间观察，对照结果不成立，此时读孔，血凝价易判高，血凝抑制价易判低。加入红细胞静置时间应按照操作规程规定的时间及时观察，超时10 min以上，红细胞发生裂解，结果不再有意义。

综上所述，在血凝和血凝抑制试验中，影响试验结果的因素很多，只有严格按规定操作，细致、耐心地做好每一个环节，发现问题及时纠正处理，才能保证试验结果的准确。