IHC和FISH检测乳腺癌组织HER-2基因扩增及蛋白表达＊

2014-01-26周海丰范玉宏武雪亮孙喜斌王立坤梁晚平刘运江

重庆医学 2014年11期

周海丰，范玉宏，武雪亮，孙喜斌，王立坤，梁晚平△，刘运江

（1.河北北方学院附属第一医院乳腺外科，河北张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院血管腺体外科，河北张家口 075000；3.河北北方学院附属第一医院检验科，河北张家口 075000；4.河北北方学院附属第一医院超声医学科，河北张家口 075000；5.河北省肿瘤医院乳腺中心，河北石家庄050000）

周海丰1，范玉宏1，武雪亮2，孙喜斌3，王立坤4，梁晚平1△，刘运江5

目的分析比较荧光原位杂交（FISH）与免疫组织化学（IHC）检测乳腺癌组织HER-2基因扩增或蛋白表达情况。方法选择2008年1月至2012年5月行改良根治术的乳腺癌患者110例，对手术切除的乳腺癌组织均予以FISH与IHC检测，对检测结果进行比较分析。结果110例乳腺癌组织中 HER-2蛋白表达为（＋＋＋）者25例（22.73%）；（＋＋）者44例（40.00%）；（＋）者26例（23.64%）；（－）者15例（13.64%）。110例乳腺癌组织中 HER-2基因扩增28例（25.45%），无扩增82例（74.55%）。IHC检测阳性（＋＋＋）与FISH的阳性符合率一致，IHC检测阴性（＋／－）与FISH的阴性符合率一致，IHC检测可疑阳性（＋＋）与FISH结果比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。但IHC检测结果与FISH检测结果的总符合率为89.29%（25／28），两种检测方法呈正相关（χ2＝84.89，P＜0.01）。结论IHC阳性及阴性表达，与FISH检测结果具有较好一致性。IHC可疑阳性表达，与FISH检测结果的一致性较差，提示IHC检测可疑阳性标本需再以FISH检测。

基因，erbB-2；原位杂交，荧光；免疫组织化学

乳腺癌作为女性常见的恶性肿瘤之一，严重地威胁到妇女的生命健康。临床上对于乳腺癌的治疗遵循着早发现，早诊断的原则［1］。然而，预后却始终受到多方面因素的影响。HER-2作为乳腺癌治疗的重要因子，其过度表达或基因扩增直接关系到患者的激素、化学治疗效果以及预后，对临床治疗有重要的意义［2－3］。本文通过对110例行改良根治术的乳腺癌患者资料，分析比较荧光原位杂交（FISH）与免疫组织化学（IHC）检测乳腺癌组织HER-2基因扩增或蛋白表达情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择河北北方学院附属第一医院乳腺外科2008年1月至2012年5月行改良根治术的乳腺癌患者110例，均为女性，年龄32～69岁。采用恶性肿瘤诊疗规范乳腺癌病理分类：其中浸润性导管癌33例，浸润性小叶癌14例，髓样癌21例，小管癌10，导管内癌18例，原位癌14例。其中有淋巴结转移者48例，无淋巴结转移者62例。肿瘤直径小于2cm者39例，2～5cm者63例，大于5cm者8例。所有标本采用10%甲醛进行固定，石蜡包埋，标本组织切片厚度以4～5μm为准。110例患者在术前均未接受任何治疗。

图1 IHC检测HER-2蛋白（＋＋＋）

图5 FISH检测HER-2基因扩增阳性

图6 FISH检测HER-2基因扩增阴性

1.2 方法

1.2.1 IHC检测本次实验采用IHC，其中兔抗人 HER－2多克隆抗体购自武汉博士德公司。一抗工作浓度为1∶100，二抗为1∶200。标本统一行IHC链霉菌抗生物蛋白－过氧化物酶连结法（SP）实验，SP与3，3-二氧基联苯胺（DAB）试剂盒均购自北京中山金桥公司，按照试剂盒操作说明进行。

1.2.2 FISH检测 FISH是用于17号染色体着丝粒和HER-2基因扩增情况下乳腺癌诊断的一类新技术，与IHC相比更为准确，被认为是HER-2基因监测的金标准。实验步骤如下：（1）提取细胞核，从石蜡包埋组织中提取细胞核，对包埋组织进行HE染色；显微镜下确定肿瘤细胞的密集部位，石蜡切片，厚度以20μm为准。（2）细胞核阵列制作，利用细胞阵列技术将ICH检测中HER-2阴性标本的血细胞排列在同一张切片上。（3）FISH，细胞阵载玻片浸入固定液体中固定1h，取出在25℃中干燥；置入pH＝6.0的柠檬酸盐缓冲液中微波加热10min；置入2×SSC溶液中，37℃，15min；0.4%胃蛋白酶中适当消化；分别用70%、85%、100%乙醇脱水处理2min；置入45～50℃烤箱中蒸发乙醇；加入10μL HER-2／neuDNA探针；封口胶封闭，37℃孵育6～15h；清洗探针，行4′，6-二脒基－2-苯基吲哚二盐酸盐（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色。

1.2.3 阳性结果的判定标准以细胞膜呈现清晰棕褐色或棕黄色为阳性。HER-2定位于细胞膜或细胞质，按照阳性细胞百分比定性。3位研究人员对结果进行判读，每张切片至少观察10个高倍视野（400倍）中大于或等于500个细胞。采用DAKO HerceptTest评分系统：（－）表示无细胞染色或少于10%细胞膜较弱染色；（＋）表示10%肿瘤细胞膜部分较弱染色；（＋＋）表示10%肿瘤细胞膜完全较弱或中等染色；（＋＋＋）为大于10%的肿瘤细胞膜完全强染色。按照阳性细胞占所观察细胞的比例行半定量分级：阳性反应小于10%为（－），10%～30%为（＋）。＞30%～50%为（＋＋），＞50%为（＋＋＋）。以（－）、（＋）及（＋＋）计入阴性表达，（＋＋＋）记为阳性表达［4］。

1.3 统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行分析，HER-2与临床病理指标关系的比较，采用行X列表进行χ2检验，以α＝0.05为检验水准，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IHC检测结果 110例乳腺癌组织中HER-2蛋白表达为（＋＋＋）者25例（22.73%），（＋＋）者44例（40.00%），（＋）者26例（23.64%），（－）者15例（13.64%），见图1～4。2.2 FISH检测结果 110例乳腺癌组织中HER-2基因扩增28例（25.45%），无扩增82例（74.55%），见图5～6。

2.3 两者结果比较本组实验中IHC检测（＋＋＋）后行FISH 检测的符合率为96.00%（24／25），IHC检测（＋＋）后行FISH 检测的符合率为 4.55%（2／44），IHC 检测（＋）后行FISH 检测的符合率为96.15%（25／26），IHC检测（－）后行FISH检测的符合率为93.33%（14／15）。即IHC检测阳性（＋＋＋）与FISH的阳性符合率一致，IHC检测阴性（＋／－）与FISH的阴性符合率一致，IHC检测可疑阳性（＋＋）与FISH结果的一致性较差。但IHC与FISH检测结果的总符合率为89.29%（25／28），两种检测方法呈正相关（χ2＝84.89，P＜0.01），见表1。

表1 110例乳腺癌样本IHC与FISH结果比较（n）

续表1 110例乳腺癌样本IHC与FISH结果比较（n）

3 讨论

国内外在研究HER-2基因表达方面的实验或临床的文献都普遍存在样本容量较小的问题［5］，部分还出现了结论不一致甚至相悖的现象，对于HER-2检测主要靠显微镜等设备来观察，很大程度上局限于观察者个人的经验和状态，同时检测结果也并没有标准、客观的依据，对于HER-2基因检测方法的选择依旧存在较大的争议，尽管IHC检测应用范围较广，但却存在明显的不足，而FISH的应用却因价格问题迟迟得不到定论［6］。而针对IHC和FISH法在HER-2基因检测中的优劣势比较，可分析此两种检测方法的差异所在，完善HER-2实验室检测的标准，提高检测结果的准确率，力求为临床提供一种简便、便宜、准确、迅速的检测方式［7－8］。

IHC因有组织标本所需量小、操作简便、要求不高、价格低廉、实验过程短、染色片易于保存、阅片快等优势，使得其仍为评价HER-2状态的首选检测方法［9－10］。虽然IHC具有上述优势，但因标本处理中使得蛋白容易破坏等因素使得IHC的准确性易受到影响。FISH有别于IHC的主要特点为结果的定量判读，其避免了主观上的误差，且有高度的可靠性与重复性［11］。聂克克等［12］研究表明，FISH 检测 HER-2蛋白有很高的假阳性及假阴性，FISH有效性及准确性显著高于IHC，可在临床广泛推广应用。HER-2基因扩增与腋窝淋巴结阳性相关。韩晓红等［13］研究表明，FISH和IHC两种方法检测HER－2表达状态具有较高的一致性，结合实际情况包括费用仪器等限制，在IHC作为初筛的基础上，仍然推荐FISH作为检测HER-2基因扩增的标准方法。FISH技术检测乳腺癌患者HER-2基因表达状态可为临床指导用药和预后评价提供更可靠的依据。张宏等［14］研究表明，IHC可作为筛查乳腺癌患者HER-2的首选方法，当 HER-2蛋白表达为（－）或（＋＋）时，IHC和FISH检测的一致性较高；而对于IHC为（＋）或（＋＋）的患者应再进行FISH检测，以确定HER-2基因表达。宋宝等［15］研究表明，FISH较IHC检测HER-2表达准确性更高，尤适用于对IHC（＋＋）的患者判断HER-2的表达。乳腺癌原发灶与转移灶之间HER-2的表达存在一定的不一致性，本文研究结果表明，IHC检测阳性（＋＋＋）与FISH的阳性符合率一致，IHC检测阴性（＋／－）与FISH的阴性符合率一致，IHC检测可疑阳性（＋＋）与FISH结果的一致性较差。但IHC与FISH检测结果的总符合率为89.29%（25／28），两种检测方法呈正相关（χ2＝84.89，P＜0.01）。

综合上述，IHC阳性及阴性表达，与FISH检测结果具有较好一致性。IHC可疑阳性表达，与FISH检测结果比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示IHC检测可疑阳性标本需再以FISH检测，而阳性与阴性标本可无须再检。

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Fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry for detecting HER-2 gene amplification and protein expression in breast cancer tissue＊

ZhouHaifeng1，FanYuhong1，WuXueliang2，SunXibin3，WangLikun4，LiangWanping1△，LiuYunjiang5
（1.DepartmentofBreastSurgery，FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity，Zhangjiakou075000China；
2.DepartmentofVascularGlandSurgery，FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity，Zhangjiakou075000China；
3.DepartmentofClinicalLaboratory，FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity，Zhangjiakou075000China；
4.DepartmentofUltrasound，FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity，Zhangjiakou075000China；
5.DepartmentofBreastSurgery，HebeiProvincialTumorHospital，Shijiazhuang，Hebei050000China）

ObjectiveTo analyze and compare the fluorescence in situ hybridization（FISH）and immunohistochemical（IHC）for detecting HER-2gene amplification and protein expression in breast cancer tissues.Methods110cases of breast cancer from January 2008to May 2012receiving the modified radical mastectomy were selected.The resected breast cancer tissue was detected by FISH and IHC and the detected results were performed the comparative analysis.ResultsAmong 110cases of breast cancer tissue，25cases（22.73%）were the HER-2protein expression（＋＋＋），44cases（40.00%）were（＋＋），26cases（23.64%）were（＋）and 15cases（13.64%）were（－）.Among 110cases，the gene amplification was in 28cases（25.45%）and no gene amplification was in 82cases（74.55%）.The positive（＋＋＋）of the IHC detection was coincident with that of FISH，and the negative（＋／－）of the IHC detection was also coincident with that of FISH，there was statistical difference between the suspicious positive of the IHC detection and the results of FISH（P＜0.05）.But the total coincidence of the IHC detection results and FISH test results was 89.29%（25／28），and the two detection methods had the positive correlation（χ2＝84.89，P＜0.01）.ConclusionThe positive and negative expression of the IHC detection has better consistency with that of the FISH detection.However，the coincidence of the IHC suspicious positive expression and the FISH results is poor，indicating that the suspicious positive sample of the IHC detection needs to be detected by the FISH detection.

genes，erbB-2；in situ hybridization，fluorescence；immunohistochemistry

10.3969／j.issn.1671-8348.2014.11.007

1671-8348（2014）11-1299-03

河北省科技厅指导性计划资助项目（08276101D-70）。

周海丰（1979－），主治医师，硕士研究生，主要从事乳腺疾病诊治与基础研究。△

，Tel：15530396549；E-mail：DM96989＠eyou.com。

2013-09-10

2013-12-17）

论著·临床研究