代谢组学技术与糖尿病的研究

吴小秋 刘志龙

(广东省中医院珠海医院，广东 珠海 519000)

糖尿病(DM)90%以上是2型糖尿病(T2DM)。根据国际DM联盟(IDF)统计，在2000年全球有DM患者1.51亿，估计到2030年有近5亿人。我国近年来研究显示DM患病人群逐年上升〔1～4〕，总DM患病率为9.7%，据此推算，在我国成年人中DM人数有9 240万〔5〕。

1 代谢组学技术的概念

代谢组学指的是单个细胞、组织、器官或体液中所有小分子代谢物的集合，主要包括基因调控生物体在代谢过程中形成的中间产物和最终产物，即有机体内合成的代谢物便构成了代谢组，是关于生物体系内源代谢物质种类、数量及其变化规律的科学。它研究的是生物整体、系统或器官的内源性代谢物质及其与所受内在或外在因素影响的关系〔6〕；是运用多元统计学和模式识别技术，对细胞或有机体中由于扰动作用而引起的代谢物变化进行全面系统研究的学科，常运用的技术包括磁共振、高效液相色谱和气相色谱-质谱技术〔7〕。

2 代谢组学技术在DM领域研究的可行性

DM是一组以长期高血糖为主要特征的代谢综合征，由于胰岛素缺乏和(或)胰岛素生物作用障碍导致糖代谢紊乱，同时伴有脂肪、蛋白质、水、电解质等代谢障碍〔8〕。而代谢组学通过对DM生物样品的代谢谱分析，获得内源性代谢产物的信息，从而找到可以反映DM的病理和发展进程的生物标记物〔7〕。代谢组学技术如何运用于DM研究？首先，代谢组学的研究对象代谢产物组是基因和蛋白表达的终端产物，是判断健康、疾病和治疗效果的分子集合，反映的是基因、环境、致病因素、营养、药物、时间等诸多因素综合作用于机体后的总反应；另一方面，DM是一种内分泌代谢紊乱性疾病，通常表现的是整体的代谢紊乱，传统的研究方法只能从单个或几个大分子成分阐述糖尿病，对DM的早期诊断及病因病机研究困难较大。代谢组学技术主要测定生物体液(如血液、尿液)、细胞提取物和组织或者组织提取液中所有分子量小于1 000 kD的小分子代谢物组信息，揭示的是系列关联生物标记物的综合差异，可从整体上全面分析疾病对生物系统的影响，要比传统依赖单一标志物的诊断方法具有更高的准确性〔9〕。因此，以生物体液为研究对象的代谢组学技术将对DM的整体性研究有直接意义〔10，11〕。

3 研究现状

3.1代谢产物的研究 当前代谢组学研究中存在两个难点同时也是热点问题：一是代谢产物的定性、定量分析，二是代谢产物复杂数据分析体系中有用信息的提取和挖掘。而DM的研究也正是从这个问题出发。目前在DM代谢产物分析方面，临床与实验研究已作了初步探讨，找到部分代谢产物作为参考。如利用气相色谱-质谱联用仪，结合化学计量学方法中的多元分辨和模式识别方法，对T2DM及相关疾病患者血浆中的脂肪酸代谢谱进行了全面、细致的研究，筛选出3个潜在的生物标记物：油酸、α-亚麻酸和二十碳五烯酸〔12〕。代谢产物的筛选为DM的临床诊断和评价治疗效果具有非常重要的意义。另一项研究在对DM的氨基酸代谢谱研究方面发现有7种氨基酸(Arg、Cit、Asp、Asn、Thr、Leu、Trp)与DM相关，可作为反映血糖值高低变化的标志物组，对于DM的早期诊断及深入研究具有潜在的科研及临床价值〔13〕。而在研究初诊DM患者代谢产物时发现，初诊DM患者主要代谢产物差异主要为游离脂肪酸、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂和磷脂酰胆碱等〔14〕。

除了运用气相色谱-质谱技术研究代谢组学产物方面，还可利用磁共振技术。如在探讨肾虚痰瘀型T2DM患者血清代谢变化及发生机制时发现，血清中多种氨基酸如异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、1-甲基组氨酸显著降低，而且乳酸、柠檬酸、肌酸及肌酸酐也较健康人显著降低，同时肾虚痰瘀型T2DM患者血清中α-葡萄糖及β-葡萄糖较健康人增加，为肾虚痰瘀型T2DM患者代谢产物作了初步研究〔15〕。而在糖尿病患者中医气虚和气阴两虚方面的研究中，找到了花生四烯酸和油酸这两种可作为虚证重要信息的潜在标志物〔16〕。以上研究结果提示，T2DM的代谢产物参与了DM的代谢。因此对T2DM的代谢产物通过运用代谢组学技术分析有助于DM早期诊断及用药疗效评价。

3.2实验研究 通过运用磁共振的代谢组学方法检测链脲霉素诱导DM模型大鼠的尿液、血清及肝脏提取物，发现3种小分子代谢物甘油三酸酯、脂肪酸和乙酰乙酸的含量变化具有显著性差异，这3种小分子物质可能成为DM诊断的潜在生物标记物，为深入分析DM的小分子发病机制作了初步的探讨〔10，17〕。而在探讨甲基莲心碱对T2DM模型大鼠尿液的代谢产物的影响，结果发现甲基莲心碱处理组大鼠空腹血糖较DM模型组降低，且发现基莲心碱处理组大鼠代谢产物中二羟延胡索酸下降，前列腺素I2、脂氧素A4、脂氧素B4升高〔18〕。

在另一项实验研究中通过运用氯甲酸乙酯(ECF)衍生和气相色谱-质谱检测联用发现T2DM大鼠尿液代谢谱主要有10个生物学标记物(琥珀酸、亮氨酸、异亮氨酸、醋酸、丙氨酸、对羟基苯乙酸、柠檬酸盐、马尿酸、甘氨酸、丙酸)〔19〕。在研究黄连治疗T2DM的机制时发现，T2DM大鼠发现12个差异代谢物显著上升；给药黄连后，其中的4个代谢物中苯甲酸、氨基丙二酸、丁四醇、核糖酸的相对含量显著下降；3个代谢物2，3-二羟基丁酸、L-抗坏血酸、3-羟基己二酸的相对含量显著上升〔20〕。在DM代谢组学与中医证候方面的研究中，发现DM肾阴虚证大鼠血液的代谢组学变化主要有甘氨酸、乳酸、尿素、D-葡萄糖、葡萄糖、半乳糖含量均显著升高〔21〕；而其在另一DM肾阴虚证尿液的代谢表型的实验研究方面，发现尿液中包含的甘氨酸、琥珀酸含量显著升高，十六烷酸、胆固醇含量显著下降〔22〕。

3.3临床研究 在研究交泰丸对T2DM的代谢产物时发现，T2DM患者葡萄糖、糖蛋白、低密度脂蛋白、β-羟丁酸、乙酰乙酸、丙酮酸、肌氨酸酐、甘氨酸较高；乳酸、氨基乙磺酸、琥珀酸、柠檬酸、谷氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、缬氨酸较低，经交泰丸治疗后葡萄糖、糖蛋白、低密度脂蛋白、β-羟丁酸、乙酰乙酸、丙酮酸较低；琥珀酸、柠檬酸、谷氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、缬氨酸较高〔23〕。而在观察络沙坦治疗DM代谢产物时结果提示葡萄糖醇和肌醇等代谢物发生变化，为临床早期判断药物疗效提供思路〔24〕。

3.4DM并发症的代谢组学研究 并发症主要有DM血管病变、神经病变等。目前代谢组学在DM慢性并发症的研究中较多的主要是DM肾病(DN)。在DM的代谢组学实验研究中，通过运用磁共振技术分析DM小鼠血浆中的小分子代谢物，结果发现血浆中葡萄糖和氧化三甲胺的含量升高，多种氨基酸含量下降，实验研究结果为临床诊断及机制研究提供新思路〔25〕。而在另一项DN的实验研究中发现，DN大鼠肾皮质中出现了明显的脂质代谢异常：多种磷脂(PC、PE、SM)含量明显降低，而甘油三酯含量明显上升，证明这些代谢物相关代谢途径的异常可能与DN的进展密切相关〔26〕。在T2DM小鼠模型中研究肾脏代谢表型的变化发现，乳酸和糖等代谢物的含量显著升高，而谷氨酸、乙酸、胆碱和甘氨酸的含量显著降低〔27〕。

在临床方面，于欢等〔28〕通过运用超高效液相色谱-飞行时间质谱方法，分析DN患者血浆代谢物变化差异，发现磷脂代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢、嘌呤嘧啶代谢、固醇类代谢等多个代谢途径发生变化，并证明糖肾方可纠正以上代谢产物的变化。在比较正常人、T2DM患者、DN患者3个人群的晨尿，结果发现，DM患者较健康对照组尿中代谢产物如赤藓糖醇、2，3，4，5-四羟基戊酸、D-果糖、木糖醇、D-半乳糖，戊糖醇显著增加；DN尿中代谢代谢产物如赤藓糖醇、2，3，4，5-四羟基戊酸、D-果糖、木糖醇、2，3-二羟苯丙酸、葡糖醛酮、D-呋喃核糖较健康对照组显著增加〔29〕。

4 研究展望

代谢组学技术作为后基因时代的一项新的技术，属于系统生物学一个分支。虽然到目前为止代谢组学技术的临床、实验研究尚不如基因、蛋白质组学研究，但其最大的优势在于可全景监测小分子代谢终端产物的变化，在疾病研究方面有极大可开发性。而这正符合DM作为一种内分泌代谢疾病的特点〔10〕。

针对目前研究现状，代谢组学技术的研究尚存在不少困难，主要有：①代谢产物的多样性。在DM的前期实验与临床研究中，不乏发现其代谢产物多样，且同一疾病在不同实验条件、对象下的代谢产物均可能不统一，给最终结果带来不确实性，因此实验、临床研究可重复性尚不确定；②代谢组学技术要求较高。目前我国代谢组学研究尚属起步阶段，技术不十分成熟，且对技术要求较高，仅有为数不多的科研机构有相关的技术人员配备；③临床研究较少。目前代谢组学技术刚刚起步不久，主要是实验室研究，而临床研究较少，尚不能充分为临床服务，解决临床实际问题；且在DM的研究中主要侧重于T2DM，而对1型糖尿病的研究较少；④研究方法多样。目前主要应用于代谢组学的方法有磁共振、高效液相色谱和气相色谱-质谱技术。这些技术在检测中互为补充，但均不能替代。因此寻找高通量、高分辨率的分析检测技术是一个重要问题。

5 参考文献

1中华医学会糖尿病学分会.中国2型糖尿病防治指南〔M〕.北京：北京大学医学出版社，2011：1.

2Wild S，Roglic G，Green A，etal.Global prevalence of diabetes：estimates for the year 2000 and projections for 2030〔J〕.Diabetes Care，2004；27(5)：1047-53.

3中华医学会糖尿病分会网站：http：//cdschina.org/news_show.jsp?id=325.html.

4Shaw JE,Sicree RA,Zimmet PZ.Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030〔J〕.Diabetes Res Clin Pract，2010；87(6)：4-14.

5Yang W，Lu J，Weng J，etal.Prevalence of diabetes among men and women in China〔J〕.New Engl J Med，2010；362(12)：1090-101.

6Nicholson JK，Connelly J，Lindon JC，etal.Metabonomics：a platform for studying drug toxicity and gene function〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2002；1(2)：153.

7符方方，冯毅凡，姜苗苗，等.代谢组学在糖尿病生物标记物发现中的应用〔J〕.中国糖尿病杂志，2012；20(3)：232-4.

8廖二元.内分泌学〔M〕.北京：人民卫生出版社，2010：1354.

9Dettmer K,Aronov PA,Hammock BD.Mass spectrometry-based metabolomics〔J〕.Mass Spectrom Rev，2007；26(5)：51-78.

10阮利君，葛卫红，江叔奇.代谢组学技术在糖尿病研究中的应用〔J〕.亚太传统医药，2011；7(10)：178-80.

11李海静，吴胜明，李 昱，等.代谢组学技术在糖尿病研究中的应用〔C〕.中国化学会.第六届全国化学生物学学术会议论文摘要集.中国化学会，2009：128.

12谭斌斌.2型糖尿病患者血浆中脂肪酸代谢谱的研究〔D〕.长沙：中南大学，2010.

13韩晓菲，黄宇虹，王龙星，等.血浆氨基酸代谢谱与糖尿病相关性研究〔J〕.分析化学，2010；38(5)：697-701.

14赵素敏，郑 虹，路 鑫，等.基于液相色谱与质谱联用的代谢组学及磷脂轮廓分析在糖代谢异常研究中的应用〔J〕.色谱，2011；29(4)：307-13.

15尤 丽，巴吐尔·买买提明，哈木拉提·吾甫尔，等.基于核磁共振的肾虚痰瘀型2型糖尿病患者血清代谢组学研究〔J〕.科技导报，2012；30(8)：25-9.

16徐文娟，黄宇虹，王龙星，等.血浆游离脂肪酸代谢轮廓柱前衍生定量方法在糖尿病患者中医虚证分型中的应用〔J〕.色谱，2010；28(6)：547-50.

17Zhao L，Liu X，Xie L，etal.HNMR based metabonomic analysis of metabolic changes in strep tozotocin induced diabetic rats〔J〕.Anal Sci，2010；26(12)：1277-82.

18刘双梅，李桂林，汤晓丽，等.甲基莲心碱对2型糖尿病模型大鼠作用的代谢组学研究〔J〕.中国药理学通报，2012；28(4)：490-5.

19袁 琳，白永生，周明眉，等.2型糖尿病大鼠的尿液代谢组学改变〔J〕.中国实验动物学报，2011；19(2)：111-4，189.

20王 静，袁子民，孔宏伟，等.基于气相色谱-质谱联用的代谢组学用于黄连治疗Ⅱ型糖尿病的机理探索〔J〕.色谱，2012；30(1)：8-13.

21孙永宁，冯 雯，刘 忠.糖尿病肾阴虚证模型大鼠血液标本的代谢组学研究〔J〕.山东中医药大学学报，2010；30(1)：80-2.

22孙永宁，刘 忠，冯 雯.糖尿病肾阴虚证模型大鼠尿液的代谢组学研究〔J〕.成都中医药大学学报，2009；32(2)：69-71.

23黄召谊.交泰丸的药代动力学及其治疗2型糖尿病的代谢组学研究〔D〕.武汉：华中科技大学，2011.

24袁凯龙，石先哲，路 鑫，等.洛沙坦治疗糖尿病的气相色谱代谢组学〔J〕.中国医学科学院学报，2007；29(6)：719-24.

25孙立业，毛 璇，张冬娟，等.Ⅱ型糖尿病肾病模型db/db小鼠血浆的代谢组学研究〔J〕.中国医药导报，2012；9(13)：19-21.

26赵 铁，张浩军，李 平.基于肾皮质代谢组学的柴黄益肾颗粒治疗DN机制的研究〔C〕.中国中西医结合学会肾脏疾病专业委员会.中国中西医结合学会肾脏疾病专业委员会2011年学术年会暨2011年国际中西医结合肾脏病学术会议论文汇编.中国中西医结合学会肾脏疾病专业委员会，2011：82-3.

27毛 璇，张冬娟，管又飞，等.2型糖尿病肾病小鼠肾水提物代谢组学研究〔J〕.波谱学杂志，2010；27(4)：532-9.

28于 欢，黎 莉，梁琼麟，等.代谢组学应用于糖肾方治疗糖尿病肾病的疗效评价〔J〕.色谱，2011；29(4)：320-4.

29刘 洋.糖尿病肾病代谢组学的研究〔D〕.乌鲁木齐：新疆大学，2011.