脯-甘氨酸环二肽对小鼠免疫功能的影响

田 颖 王 刚

(陕西科技大学生命与工程学院，陕西 西安 710000)

环二肽在多种生物中均有发现，具有较强的抗癌、抗菌、调节激素、调控能量代谢、调节TRH、抗氧化活性及促进记忆等功能〔1〕。目前发现的环二肽很多都具有很强的生理活性，例如抗菌、抑制肿瘤等，因此，引起化学、药学及医学领域研究者的广泛关注。本研究对脯-甘氨酸环二肽的免疫活性进行多项目研究，拟为新型免疫激活剂的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1药品及实验动物 脯-甘氨酸环二肽(由丹参内生菌Bacillusaryabhattai发酵、纯化发酵液获得，菌种由西北农林科技大学薛泉宏教授提供)，昆明种健康小鼠，雌性，体重18～21 g，由第四军医大学实验动物中心提供。

1.2实验设计

1.2.1受试物配制 低、中、高剂量环二肽组纯肽加量分别为1.5、2.5、5.0 mg，分别加生理盐水至10 ml。对照组不加任何纯肽。

1.2.2实验对象 将小鼠饲养3 d后，按体重随机分为4个组：高剂量给药组、中剂量给药组和低剂量给药组、对照组，每组10只。各剂量组灌胃给药。灌胃量为0.2 ml/10 g。

1.3试验项目及方法〔3〕

1.3.1碳廓清实验

1.3.1.1仪器及材料 752分光光度计、印度墨水,碳酸钠，瑞氏染粉等。

1.3.1.2试验方法及步骤〔3〕小鼠适应性饲养3 d后按体重随机分为：环二肽试剂高、中、低剂量组及空白对照组4个剂量组，每组10 只小鼠；各给药剂量组每天分别按计量灌胃1次，对照组给予生理盐水灌胃，连续21 d，期间小鼠自由取水饮食。将印度墨汁原液用生理盐水稀释3～4倍。取0.1 g Na2CO3，加蒸馏水至100 ml。在给药后的第21天，按体重依次给小鼠尾注射墨汁(100 ml/kg)，注入墨汁，同时计时。在2、10 min时,每鼠均由内眦静脉丛采血各20 μl,分别放于2 ml、0.1%Na2CO3溶液中摇匀，待测。处死小鼠取肝脾称重。用752分光光度计，在600 nm波长处测定各管光密度值(OD),吞噬指数。受试物组的吞噬指数与对照组比较。

1.3.2抗体生成细胞检测(PFC)

1.3.2.1材料和仪器 CO2培养箱、补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、SRBC、琼脂糖、0.5%琼脂糖薄膜玻片；微量血凝实验板。

1.3.2.2实验方法 小鼠分组及给药同碳廓清实验，连续灌胃16 d，于给药后的第16天，用2%SRBC(0.2 ml/鼠)腹腔注射免疫小鼠。免疫后第5天，脱颈椎处死动物，取脾脏，补体及脾细胞悬液(5×106个/ml)进行溶血空斑测定。测定步骤见《保健食品功能学评价程序和检验方法》，最后将给药组的空斑数与对照组进行比较。

1.3.3血清溶血素测定 与PFC实验共用动物，实验结束日摘眼球采血，分离血清，以生理盐水倍比稀释，用微量血凝实验板，加0.5%(V/V)SRBC悬液，进行血清溶血素测定。血清凝聚程度按5级分法，逐一计算每鼠血清抗体积数。

1.3.4NK细胞活性测定(LDH)

1.3.4.1仪器和材料 酶标仪(美国伯乐680)、LDH基质液、Hank液、靶细胞(YAC-1)、U型96孔培养板、RPMI1640完全培养液及0.2 mol/LTris-HCl缓冲液等。

1.3.4.2实验方法 将乳酸锂(5×10-2mol/L)、硝基化氯氮唑(INT，6.6×10-4mol/L)、吩嗪二甲硫酸盐(PMS，2.8×10-4mol/L)及氧化型辅酶I均溶于0.2 mol/L的Tris-HCl缓冲液中，调pH8.2制成 LDH基质液。按卫生部《保健食品功能学评价程序和检验方法》〔3〕规定的方法进行靶细胞(YAC-1)传代和效应细胞的制备。小鼠分组及给药灌胃同碳廓清实验，连续21 d，期间小鼠自由取水饮食。在给药后的第21天，处死小鼠无菌取脾，在Hank液中将其磨碎，再经洗涤、离心(1 000 r/min)两次，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/L，制备成脾细胞悬液。取靶细胞和脾细胞按程序要求加入U型96孔培养板中。按要求培养离心。并吸取每孔上清100 μl并加入LDH基质液100 μl，同时置平底U型96孔培养板中，反应7 min后每孔加入1 mol/L的HCl 30 μl,在酶标仪490 nm处测定光密度值(OD)。按下式计算NK细胞活性〔3〕。

2 结 果

2.1碳廓清实验 给予不同剂量的脯-甘氨酸环二肽灌胃21 d后，高、中、低剂量环二肽组小鼠单核巨噬细胞碳粒廓清能力(5.331 1±0.965 7、5.634 5±0.595 2、5.127 9±1.226 4)与对照组(4.239 6±0.904 3)相比均有提高(P=0.038,0.006,0.109)，其中高、中剂量组的差异达到了显著水平(P<0.05)。

2.2PFC 高、低剂量组(50.80±12.682、59.70±22.232)产生的溶血空斑数与对照组(34.20±9.414)比较差异显著(P=0.048,P=0.02)。中剂量环二肽组溶血空斑(48.50±12.232)与对照组无差异(P=0.100)。

2.3血清溶血素测定 高、中、低剂量环二肽组小鼠产生的抗体积数(135.40±13.923、130.70±15.173、126.00±18.933)与对照组(101.30±16.573)比较差异显著(P均<0.05)，说明脯-甘氨酸环二肽可提高小鼠的特异性体液免疫水平。

2.4NK细胞活性测定结果 高剂量组的X值(NK转换值)与对照组差异(39.792±7.683 6、29.962±7.495 9，P=0.019)具显著差异性，中、低剂量组(26.863±7.901 3、27.737±7.732 9)，与对照组差异无显著性(P=0.698、P=0.856)。

3 讨 论

血液中的外周血单核巨噬细胞对异物颗粒的吞噬能力，是评价机体非特异性免疫功能的标志之一，通常用吞噬指数表示巨噬细胞吞噬能力的强弱〔4〕。在本研究碳廓清试验中当墨汁被注入小鼠尾静脉血液中，给药组的吞噬指数明显高于对照组，表明脯-甘氨酸环二肽能提高小鼠的单核巨噬细胞的吞噬能力〔5，6〕。 PFC实验的原理是将绵羊红细胞免疫小鼠，取小鼠脾细胞制成细胞悬液，与高浓度绵羊红细胞混合后加入琼脂糖凝胶中，其中每个释放溶血性抗体的B淋巴细胞在补体的参与下可溶解周围的绵羊红细胞，在周围形成一个可见的空斑，一个空斑代表一个抗体形成细胞，空斑的数量反映机体的体液免疫功能。本实验的各给药组所产生的空斑数均显著高于对照组，说明脯-甘氨酸环二肽能提高小鼠的体液免疫功能。小鼠血清溶血素值的高低是机体非特异性免疫功能的重要指标之一〔5，6〕,通常用溶血素值表示B细胞的增殖分化和与补体结合后向体液中分泌溶血素的能力,检验药物对机体免疫能力影响的重要手段就是测定溶血素值〔6〕。NK细胞活性是机体抗肿瘤、抗感染能力的重要标志，本研究NK细胞活性测定实验结果显示为阳性。本研究多项实验结果都显示脯-甘氨酸环二肽能在多方面发挥免疫促进的功能。

4 参考文献

1Wang DX,Liang MT,Tian GJ,etal.A facile pathway to synthesize diketopiperazine derivatives〔J〕.Tetrahedron Lett,2002;43(5):865-7.

2卫生部.保健食品功能学评价程序和检验方法〔Z〕.北京:中国人民共和国国家卫生部，2003: 119-26.

3钟建春，张 艳,等.人工冬虫夏草多糖提取物对小鼠免疫功能的影响〔J〕.中山大学学报( 自然科学版),2011;50(6):100.

4王玉凤,凤良元,鄢顺琴,等.楮实子对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠免疫功能的影响〔J〕.中华中医药学刊,2008;26(5)：1023-5.

5史 钧,晏利圣.鸡红细胞免疫吸附性能与白细胞数量关系〔J〕.生物学杂志,2005;22(2)：30-1.

6韩玉生,徐 颖,周忠光,等.强脊康对小鼠体液免疫功能影响的实验研究〔J〕.中医药信息,2007;24(4)：64-5.