环孢素A对β淀粉样蛋白25～35诱导PC12细胞损伤的保护作用

强 静 马芹颖 顾 平 王彦永 王铭维

(河北医科大学第一医院神经内科，河北 石家庄 050031)

阿尔茨海默病(AD)其主要的组织病理学特点是神经元的大量丢失和细胞外老年斑(SP)的沉积以及细胞内高度磷酸化的tau蛋白所形成的神经元纤维缠结〔1〕。大量研究表明，病理性的淀粉样蛋白(Aβ)是SP的主要组成成分，Aβ具有很强的聚集特性，其过度聚集可以通过氧化应激、影响细胞对Ca2+的缓冲能力等多种机制造成AD患者神经元大量丢失和突触的损伤〔2～4〕，在AD的发病过程中起着关键作用。研究发现，很多神经系统变性疾病都与自噬能力的下降有关〔5，6〕。有研究表明，一些药物可以提高AD模型小鼠体内的自噬水平，降低其脑内Aβ的水平，并改善小鼠的认知功能〔7〕。环孢素A(CsA)是一种临床应用广泛的免疫抑制剂，可减轻器官移植术后的排斥反应。CsA对神经系统具有一定的保护作用，如在一定程度上减轻创伤性脑损伤和促进脊髓损伤后的恢复等〔8，9〕。但是，CsA是否具有提高自噬水平的效应及对AD的病理改变有无改善作用，目前尚无明确报道。本研究探讨CsA对于Aβ25～35诱导的体外培养PC12细胞损伤有无保护作用，及其机制是否与自噬通路有关。

1 材料与方法

1.1药品及试剂 DMEM高糖培养基、马血清购自Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司；Aβ25～35、多聚赖氨酸购自Sigma公司、Hoechst、碘化丙啶(PI)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、CsA购自河北博海生物工程公司，其余均为国产分析纯试剂。

1.2细胞培养 PC12细胞为美国匹兹堡大学惠赠。细胞使用含10%胎牛血清、5%马血清、100 ng/L链霉素、0.1 U/L青霉素的高糖DMEM培养基，于37℃、5% CO2环境中培养，隔天换液一次。待细胞单层铺满培养瓶底的80%～100%时进行传代，取对数生长期细胞进行实验。Aβ25～35使用无菌磷酸盐(PBS)缓冲液稀释成1 mmol/L储存液，过滤后于37 ℃孵育5～7 d，分装冻存于-20 ℃冰箱。CsA溶于无菌二甲基亚砜(DMSO)中，储存浓度为500 μmol/L，-20℃保存备用。MTT溶于无菌PBS，浓度为5 mg/L，现配现用。

1.3MTT法检测细胞活力 将PC12细胞传代接种于多聚赖氨酸包被的96孔培养板中，接种密度约为1×104个/孔。分为空白对照组、Aβ处理组、CsA+Aβ处理组，每组设5个复孔。细胞进入对数生长期后，CsA+Aβ处理组分别给予0.1、0.5、1.0 μmol/L环孢素A预处理24 h，空白组仅更换新鲜培养液。随后除空白组外各组给予20 μmol/L的Aβ25～35，继续培养24 h。培养结束后，吸去各孔培养液，每孔注入100 μl新鲜培养液和20 μl MTT溶液。继续培养4 h后，吸净并弃去混合液，各孔中加入150 μl无水DMSO，震荡混匀10 min，酶标仪检测570 nm波长下的光密度值。每组实验重复三次，取平均值。

1.4Hoechst/PI双染法检测细胞存活率 PC12细胞传代后接种于多聚赖氨酸包被的24孔培养板中，每孔约4×104个。分组同上。经同样的CsA和Aβ处理后，吸去培养液，每孔加入无菌PBS缓冲液稀释的浓度为20 μg/ml的Hoechst染液0.5 ml，避光孵育5 min,PBS轻柔漂洗5 min×3次后，加入10 μg/ml的PI染液，避光孵育15 min。PBS轻柔漂洗5 min×3次后，使用倒置荧光显微镜观察，计数存活/死亡细胞，并计算细胞存活率。每孔随机选取5个视野，计算时取平均值进行统计，每组实验重复三次。

1.5细胞免疫荧光染色法检测PC12细胞微管相关蛋白1轻链3-β(LC3)表达水平 给予各组PC12细胞相应处理后，PBS缓冲液漂洗5 min×3次，4%多聚甲醛固定30 min。PBS缓冲液漂洗5 min×3次后，用含5%山羊血清、0.3%Triton X-100的PBS液与37 ℃封闭处理50 min，用兔多抗LC3B一抗(Abcam,1∶1 000)4 ℃孵育过夜，FITC标记的山羊抗兔IgG(1∶100)37℃孵育30 min，PBS缓冲液漂洗后以Hoechst复染胞核2 min，PBS缓冲液漂洗5 min×3次后，置于倒置荧光显微镜下观察各组PC12细胞的LC3表达情况。

1.6统计学处理 使用SPSS13.0统计软件，计量资料多组间比较采用方差分析，组间比较采用Student-Newman-Keuls检验。计数资料组间比较采用χ2检验。

2 结 果

2.1Aβ25～35与CsA对PC12细胞形态的影响 将各组PC12细胞分别进行相应处理后，置于倒置显微镜下，观察各组细胞的形态学差别。正常对照组的PC12细胞生长状态良好，胞体饱满，突起伸展充分，贴壁良好。给予20 μmol/L的Aβ25～35处理24 h后，细胞状态明显变差，胞体变暗，突起短小，视野内可见大量脱落的细胞碎片。0.1、0.5、1.0 μmol/L CsA预处理24 h后，再给予20 μmol/L Aβ25～35继续培养24 h，0.5 μmol/L CsA处理组的PC12细胞状态与单纯Aβ组相比有明显改善，贴壁良好，细胞形态较完整，细胞碎片少见。

2.2Aβ25～35与CsA对PC12细胞活力的影响 单纯Aβ25～35处理组细胞光密度值较空白组明显降低(0.38±0.015 vs 0.58±0.045，P<0.001)；0.5 μmol/L CsA预处理的PC12细胞OD值与Aβ25～35处理组相比明显增高(0.45±0.045，P<0.05)。0.1、1.0 μmol/L CsA预处理组对PC12细胞活力(0.31±0.018，0.34±0.034)及代谢状态无明显改善作用。

2.3Aβ25～35与CsA对PC12细胞存活率的影响 以PI标记死亡细胞，Hoechst标记所有细胞胞核，对活细胞和死亡细胞进行区分。空白对照组细胞存活率最高(98%)，20 μmol/L Aβ25～35处理组(81.8%)细胞存活率较对照组明显降低(P=0.007)；0.5 μmol/L CsA预处理24 h(95.9%)后，再加入Aβ继续培养24 h，细胞存活率较单纯Aβ组有明显改善(P=0.012)。

2.4Aβ25～35与CsA对PC12细胞自噬的影响 倒置荧光显微镜下观察可以发现，正常PC12细胞的LC3荧光较强，反映出其基础自噬水平较高；Aβ25～35处理组细胞LC3荧光强度下降明显，说明给予20 μmol/L Aβ25～35可以明显抑制PC12细胞的自噬活性，而在给予Aβ25～35之前对细胞进行0.5 μmol/L CsA预处理24 h可以明显减弱其对PC12细胞自噬活性的抑制作用。

3 讨 论

Aβ具有较强的聚集能力，聚集后形成的寡聚体纤维可产生神经毒性，是导致神经元变性、丢失乃至形成痴呆的关键因素〔10〕。目前，对Aβ25～35进行孵育使其聚集为寡聚体并用于体外神经细胞损伤模型的方法在神经科学的研究中广泛应用；而PC12细胞具有良好的神经细胞特性，因此常作为神经细胞理想的体外模型加以利用。本研究中采用20 μmol/L Aβ25～35寡聚体作用于PC12细胞24 h，细胞的形态变差，活力明显下降，并有部分细胞死亡，成功地建立了AD的体外细胞模型。

自噬是溶酶体对受损细胞器和老化、毒性蛋白进行吞噬降解的一种主动清除方式。正常细胞具有一定的基础自噬水平，以清除细胞内的变性蛋白和受损细胞器，促进体内蛋白的循环利用，这对维持细胞内环境稳定和行使正常生理功能起着积极的作用〔11〕。近期有研究发现，在AD等老年神经系统变性疾病中，存在自噬水平的降低〔12〕，可能与这类疾病的发病有关，目前其具体机制尚不明确。适度提高自噬溶酶体途径(ALP)的活性，可以加速有聚集倾向的蛋白的降解，有可能对Aβ等蛋白沉积引起的神经退行性疾病如AD起到治疗作用〔11〕。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是自噬通路中的负性调节因子，雷帕霉素是一种mTOR的特异性抑制剂。有研究表明，雷帕霉素可以改善AD动物模型受损的认知功能，在体内和体外研究中均可降低Aβ的水平〔7〕，其可能的机制为雷帕霉素抑制了mTOR的磷酸化，减轻了mTOR对自噬活性的抑制，从而提高了自噬水平，使具有毒性作用的Aβ寡聚体加速降解，最终起到保护作用。

CsA作为一种免疫抑制剂已广泛用于临床，预防器官移植术后排斥反应的发生。越来越多的研究表明，CsA还具有神经保护作用，如在一定程度上减轻创伤性脑损伤和促进脊髓损伤后的恢复等〔8，9〕。目前已知的CsA发挥神经保护作用的机制可能涉及以下方面：封闭线粒体通透性转换孔道(MPTP)，在损伤因素存在时维持线粒体结构和功能的完整，以及降低损伤部位星形细胞和小胶质细胞的过度反应活性。本研究成功建立了Aβ损伤PC12细胞的体外模型，并证实环孢素对Aβ25～35诱导的PC12细胞损伤具有保护作用。而对于作用机制的初步研究发现，这种保护作用可能与CsA提高PC12细胞的自噬活性有关,自噬通路可能是CsA发挥神经保护作用的一个新的机制。虽然CsA与雷帕霉素均为免疫抑制剂，但是两者提高自噬活性的具体机制是否相同，CsA的这种作用在体内是否仍然存在，这些问题仍需要更深入的研究。

CsA在临床上常用于预防器官移植患者的术后排斥反应，其治疗效果和不良反应相对明确，而其提高自噬活性的作用使其有望成为治疗AD的一种新型药物。

4 参考文献

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