健脾清化方在肾小球硬化大鼠中抗肾纤维化的作用及其机制

陈 晛，何立群

上海中医药大学附属曙光医院肾病科上海市中医重点临床实验室，上海200021

1982年，Moorhead等［1］首次揭示 “脂质肾毒性”，自此脂代谢紊乱作为肾小球硬化的独立危险因素开始受到研究者关注。研究证实脂质可以参与调节MAPK信号通路［2-3］、促进系膜细胞增殖［4］、刺激促纤维化细胞因子分泌［5］、介导炎症反应［6］、影响细胞外基质合成与降解的平衡［7］，从而与其他因素共同推进肾纤维化的进展。其中，炎症细胞的浸润聚集是肾纤维化的关键启动步骤和重要环节，已有大量证据表明，极低密度脂蛋白 (very low-density lipoprotein，VLDL)、中密度脂蛋白 (intermediate-density lipoprotein，IDL)、低密度脂蛋白 (low-density lipoprotein，LDL)及氧化修饰后的LDL(oxidized LDL，Ox-LDL)均可促进系膜细胞、内皮细胞、单核-巨噬细胞产生肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素 (interleukin，IL)-6等多种炎性因子，加剧肾间质的炎症反应［8］。TNF-α是一种具有多重生物活性的炎症因子，不仅介导巨噬细胞浸润，还可诱导多种巨噬细胞来源的促纤维化因子、炎症因子释放，刺激成纤维细胞增长和过度堆积［9］，故其在加剧肾脏炎症反应中的作用不可忽视。健脾清化方是针对慢性肾功能衰竭患者脾虚与湿热、瘀血、浊毒交杂的中医病机，由李东垣的补脾胃泻阴火升阳汤化裁而来的临床经验方剂，可明显改善肾功能及纤维化指标［10-12］。前期动物实验从改善肾脏血液动力学及氧化应激的角度观察和解释了该方对5/6肾切除大鼠肾纤维化的治疗作用［13］。本研究采用新的肾纤维化动物模型，即肾切除联合阿霉素诱导局灶节段性肾小球硬化大鼠模型，观察了该方对模型大鼠血脂及肾组织TNF-α的影响，以期从改善肾脏炎症的角度阐述该方对新模型肾纤维化的治疗作用及其机制。

材料和方法

实验动物雄性SD大鼠56只，2月龄，清洁级，体重 (200±20)g，由上海中医药大学实验动物中心提供，在上海中医药大学实验动物中心SPF级喂养，自由进食和饮水，封闭管理。适应性喂养1周。

药物健脾清化方由党参15 g、生黄芪15 g、草果仁6 g、苍术10 g、黄连3 g、制大黄9 g组成。益气健脾拆方由党参15 g、生黄芪15 g组成。清热化湿拆方由草果仁6 g、苍术10 g、黄连3 g、制大黄9 g组成。以上药材由曙光医院东院中药房统一进货。水煎浓缩为含生药2 g/ml的药液。尿毒清颗粒购自广州康臣药业有限公司 (国药准字Z1097122)。

试剂血清总胆固醇 (total cholesterol，TC)、三酰甘油 (triglyceride，TG)、LDL试剂盒购自北京北化康泰临床试剂有限公司。VLDL ELISA试剂盒购自上海裕平生物科技有限公司。TNF-α ELISA试剂盒购自英国Abcam公司 (ab100785)。

造模及分组取56只SD大鼠采用抽签法随机分为3组，8只大鼠为正常组;40只为造模组，均建立左侧肾切除联合阿霉素诱导局灶节段性肾小球硬化模型;8只为假手术组，不结扎血管且不切除左肾。造模组大鼠于手术1周后尾静脉注射阿霉素溶液3 mg/kg，手术5周后再次尾静脉注射阿霉素溶液3 mg/kg;假手术组注射同等体积的生理盐水。以血肌酐显著高于正常组 (P＜0.05)为造模成功的标准。成模后根据血肌酐值采用分层随机法将造模组大鼠分为5组 (模型组、健脾清化方组、益气健脾组、清热化湿组、尿毒清组，n=8)，使5组间血肌酐差异无统计学意义(P＞0.05)。

药物干预及标本采集正常组、假手术组、模型组喂以固定动物饲料和自来水。健脾清化方组、益气健脾组、清热化湿组分别给予相应治疗药液0.5 g/100 g，每日灌胃1次;尿毒清组给予尿毒清颗粒0.5 g/100 g，每日灌胃1次。连续8周后处死。无菌取血及肾组织，肾组织匀浆后取上清液，置于-80°冰箱中冷冻保存。

观察指标血清TC和TG采用酶法测定，血清LDL采用选择性沉淀法测量，血清VLDL和肾组织TNF-α采用ELISA法测定，步骤参照试剂盒说明书。

统计学处理采用SPSS 18.0统计软件，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

血脂指标结果比较造模成功后第8周，假手术组血清TC、TG、LDL及VLDL水平与正常组比较差异无统计学意义 (P均＞0.05);模型组血清TC、TG、LDL及VLDL水平均显著高于正常组及假手术组 (P均＜0.01);健脾清化方组、清热化湿组及尿毒清组血清TC、TG、LDL及VLDL水平均显著低于模型组(P均＜0.01)，益气健脾组血清TC、TG及VLDL水平显著低于模型组 (P均＜0.01)，但LDL水平与模型组比较差异无统计学意义 (P＞0.05)(表1)。

肾组织TNF-α测定结果比较造模成功后第8周，假手术组肾组织TNF-α水平与正常组比较差异无统计学意义 (P＞0.05);模型组肾组织TNF-α水平显著高于正常组及假手术组 (P均＜0.01);健脾清化方组、清热化湿组、尿毒清组肾组织TNF-α表达水平均显著低于模型组 (P均＜0.01)，而益气健脾组与模型组比较差异无统计学意义 (P＞0.05)(表1)。

讨 论

脾肾虚衰、湿热、瘀血、浊毒作为几种极为重要的病理因素，共同构成中国传统医学对于肾纤维化病机的认识体系。几大病理因素相互交错、相互转化形成了肾纤维化复杂的“正虚邪实”的病理状态，其中以脾肾虚衰为本，水湿内蕴、瘀血浊毒留滞为标，故临床治疗中补脾益肾、通腑泻浊、活血利湿是关键。《医方考》有云:“下焦之病，责于湿热。”临床观察显示，慢性肾病兼夹湿热证者占65% ～85%［14-15］。实验也表明，非透析慢性肾功能衰竭且伴有微炎症状态的患者，其中医辨证中夹有湿热证者，微炎症状态程度最明显［16］。基于湿热在肾脏炎症状态中的重要地位，健脾清化方确立“益气健脾与清热化湿为主，同时兼用活血化瘀及通腑泻浊”的遣方用药思路，方中采用党参、黄芪益气健脾以扶正治本，脾气健旺则水湿可化，另以大黄黄连清热、苍术草果燥湿以治标，大黄尚可通腑泻浊、活血化瘀，六药合用，能使正气渐旺，湿热、瘀血、浊毒消退。前期实验证明，健脾清化方能有效降低C反应蛋白水平及炎症细胞因子IL-2、IL-6、IL-17 和干扰素-γ 的表达［17-18］。

研究提示，脂质成分及其代谢产物广泛参与肾组织炎症反应及纤维化进展。脂蛋白可激发小管上皮细胞释放内皮素、单核细胞趋化蛋白-1、血小板源生长因子、骨调素等，并能改变上皮细胞整合素的表达和分布［19］，介导细胞黏附和炎症损伤;可促进系膜细胞分泌IL-6、血小板源生长因子，促进系膜增殖和炎症反应［8］;可刺激单核细胞及肾脏固有细胞产生转化生长因子-β (transforming growth factor-β，TGF-β)，导致多种炎症因子的表达增强。Ox-LDL在肾小球损伤时可与巨噬细胞的清道夫受体结合，刺激生长因子、炎症因子的产生，使炎症反应加剧，还可上调内皮细胞中的细胞间黏附分子、血管细胞黏附分子、β2整合素水平，增强单核细胞-内皮细胞作用，介导炎症反应［19］。TNF-α是炎性介质网络中的重要成员，不仅可积聚炎症细胞，还能单独或与IL-1协同增加系膜细胞合成前列腺素E，增加血小板源生长因子和花生四烯酸的释放［8］，并能增加血管活性物质、主要组织相容性抗原、黏附分子等表达，增强炎症反应;同时促进免疫活性细胞产生 IL-1、单核细胞趋化蛋白-1、TGF-β等细胞因子，促进脂质释放［19］，共同推进肾脏炎症反应的进程。

在肾纤维化过程中，炎性细胞浸润和聚集、炎症因子和促纤因子刺激肌成纤维细胞形成是导致肾纤维化的必经步骤，另外，部分炎症因子如IL-1、TNF-α也具有很强的促纤维化作用，因此炎症是启动和推进肾纤维化的关键。

临床及药理研究发现，诸多中药可改善脂质代谢紊乱，对TNF-α产生积极影响，如黄芪中所含的黄芪多糖、大黄中所含的大黄多糖可降低血清TC、TG及LDL［20-21］，黄连中所含的小檗碱可明显降低血清TC、TG及 VLDL［22］;大黄所含的大黄素、黄芪可抑制TNF-α生成［23-24］。健脾清化方即是在上述诸药基础上构成。

本研究结果显示，模型组大鼠肾组织中TNF-α的表达与正常组比较明显升高，提示肾硬化大鼠肾组织存在明显的炎症反应，而健脾清化组的肾组织TNF-α水平与模型组比较显著降低，其效果与临床常用药物尿毒清比较差异无统计学意义，结果提示健脾清化方改善肾功能及肾纤维化的机制可能与降低TNF-α表达，从而改善肾组织的炎症状态有关。清热化湿组与模型组比较TNF-α水平也显著降低，而益气健脾组与模型组比较差异无统计学意义，进一步说明健脾清化方中清热化湿、活血泻浊药物是降低TNF-α表达的主要有效成分。同时本研究发现，与正常组及假手术组比较，模型组大鼠血脂显著上升，说明肾小球硬化大鼠存在脂质代谢紊乱，经健脾清化方干预后，大鼠的血清TC、TG、LDL、VLDL水平均显著降低，且与尿毒清组比较差异无统计学意义，提示健脾清化方改善肾功能及肾纤维化的机制可能还与全面有效纠正脂质代谢紊乱，进而改善肾脏炎症状态有关。其拆方益气健脾方、清热化湿方在降低TC、TG、VLDL方面亦有明显效果，但在改善血清LDL方面，益气健脾组与模型组比较差异无统计学意义，提示健脾清化方中的清热化湿、活血泻浊药物对于降低LDL水平起着主要作用。

综上，本研究采用临床验方健脾清化方干预肾小球硬化模型大鼠，结果显示其能明显下调血清各类脂质及肾组织TNF-α的表达，故可有效改善模型大鼠的肾脏炎症状态，最终达到抗肾纤维化的效果。

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