柔嫩艾美耳球虫体外培养方法与影响因素

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（1.太谷县动物疫病预防与控制中心，山西太谷030800；2.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

柔嫩艾美耳球虫体外培养方法与影响因素

田永清1，张妍2，郑明学2，王丽霞2

（1.太谷县动物疫病预防与控制中心，山西太谷030800；2.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

鸡球虫的体外培养方法有鸡胚培养和细胞培养两种，即球虫在鸡胚和体外培养细胞中完成从子孢子到卵囊的内生性发育过程。体外培养对深入研究球虫学及球虫病学具有重要的作用和意义。本文从细胞和鸡胚两个方面对球虫体外培养进行分析和讨论，以便为球虫病的研究提供技术支持。

鸡球虫；鸡胚培养；细胞培养；体外培养

鸡球虫病主要危害3月龄内的雏鸡，以15～50日龄的雏鸡发病率最高，死亡率可达80%以上，鸡球虫病对养鸡业危害十分严重[1-2]。寄生虫的体外培养可为寄生虫和寄生虫病学研究提供一个高效、直观的模型，是寄生虫生物学特性、诊断试剂、药物、疫苗、寄生虫与宿主相互作用研究的一个极具价值的技术平台[3]。鸡球虫的体外培养方法有鸡胚培养和细胞培养两种，即球虫在鸡胚和体外培养的细胞中完成从子孢子到卵囊的内生性发育过程[1]。

Long[4]曾报道有数种鸡球虫能在鸡胚的绒毛尿囊膜上发育，但只有E. tenella 子孢子接种鸡胚后能获得卵囊。1972年，Long[4]首次用鸡胚传代的方法培育出E.tenella致弱虫株，建立了球虫鸡胚培养技术。李艳琴等报道[5]，张勤和杨振中等分别采用Long的鸡胚传代方法建立了鸡胚传代株。细胞培养几乎与鸡胚培养同步发展，Patton等[6]首次报道了E. tenella在细胞培养中的发育。1970年，Doran[7]首次报道了E.tenella在鸡原代肾细胞中发育到卵囊。

球虫的体外培养包括：①制备待培养物，如子孢子和裂殖子的制备等；②创造和优化人工环境，即进行细胞培养和鸡胚培养，并用生化方法和物理方法调整人工环境，使之尽可能接近自然宿主所提供的环境；③将待培养物接种于优化的人工环境中[8]。下面从上述3方面对球虫体外培养作简要分析。

1 子孢子的分离纯化[8]

分离出无菌、无杂质的子孢子是体外培养的基础，要获得纯化的子孢子，必须先收集纯化卵囊。目前主要的收集卵囊的方法是漂浮法、蛋白酶消化法、糖溶液梯度消化法、离心淘析法、激光显微镜分离法、单卵囊分离法等，其中饱和盐水漂浮法最常用。用于体外培养的卵囊从肠道中纯化比从粪便中获得的效果更好。对孢子化卵囊的除菌常用次氯酸钠，对子孢子无毒害。子孢子的脱囊分机械消化法和直接消化法。直接消化法是在卵囊壁完整无损的条件下，直接利用CO2和消化液的作用，消化卵囊和子孢子壁，释出子孢子；机械消化法是先借助机械力破坏卵囊壁，释出孢子囊，再用消化液消化孢子囊，释出子孢子，这种方法也是目前释放卵囊的最好方法。谢明权等[9]通过试验研究发现，用0.125%胰蛋白酶和0.175%胆酸盐（TDC）脱囊45 min，脱囊率可达95%；用0.125%胰蛋白酶和5%～10%鸡胆汁，脱囊75 min，脱囊率达到91%和95%。对于子孢子的提纯，宋翠平等[10]研究表明，DEAE-纤维素柱虽经酸碱处理和无菌溶液洗脱，但其装置的缺陷性使其无法保证严格无菌，易造成细胞培养中的污染。而玻璃珠柱则能高压灭菌，且可移入超净工作台中无菌操作，获得的子孢子基本无菌。G漏斗过滤的子孢子仍有少量杂质，但易无菌操作，适宜于对子孢子纯度要求不高的鸡胚培养[1]。

2 鸡胚培养

1965年，Long[4]首次报道了堆型艾美耳球虫在鸡胚中可以完成整个发育史。随后Shibalova和Long陆续报道了毒害艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫、脆弱艾美耳球虫可在鸡胚发育。谢明权等[11]用鸡胚连续繁殖柔嫩艾美耳球虫24代，建立了柔嫩艾美耳球虫鸡胚适应株。鸡胚繁殖球虫的成功，不仅为研究球虫疫苗和防治药物提供了新的技术平台，而且为开展球虫分子生物学研究提供了保证。影响球虫在鸡胚发育的因素主要有[8]：

2.1 虫源性因素

虫种不同在鸡胚中生长发育和致病性存在很大差异，同一种球虫的潜隐期存在种内差异。柔嫩艾美耳球虫的虫株经连续传代变成的胚胎适应株，与未曾传代的父代株相比，产生的卵囊量多，但致病力弱。用不同剂量的球虫子孢子接种鸡胚，随接种剂量的增大，鸡胚的死亡率可达100%。此外，卵囊保存时间的长短也影响鸡胚的死亡率及平均病变数。

2.2 胚源性因素

不同品系的仔鸡和鸡胚在接种球虫后的易感性存在差异。

2.3 环境性因素

柔嫩艾美耳球虫在41℃下的发育比在稍低的温度下发育要快。研究还发现胚胎中柔嫩艾美耳球虫在低于41℃条件下孵育，卵囊的生产减少和延迟。在接种前对鸡胚进行药物处理后，产生的配子体数目有所改变。

3 细胞培养

3.1 虫源性

和鸡胚培养一样，接种球虫子孢子的保存时间、接种剂量以及对子孢子接种前的处理等都对其在细胞中存活、发育有很大影响。

3.2 细胞源性

艾美耳球虫在有些细胞中存活和发育比在其它一些细胞中要好。对接种子孢子后尚不能在细胞培养中完成生活史的艾美耳球虫来说，最适宜其尽可能向前发育的细胞一般是天然宿主细胞。国内外培养鸡球虫常用的细胞类型为鸡肾原代细胞和鸡胚肾细胞，对柔嫩艾美耳球虫而言，最适宜的细胞是鸡盲肠上皮细胞。此外，培养细胞的密度及在原代培养建立之前，组织被胰蛋白酶消化的程度对柔嫩艾美耳球虫的发育也有一定影响。

3.3 温度

不同温度对子孢子发育到卵囊有直接影响，柔嫩艾美耳球虫在41℃下可发育至成熟裂殖体，在37℃下则不能，鸡的正常体温为41℃左右，体外细胞培养的温度应严格模拟宿主体内温度[12]。

3.4 培养基

Doran[6]比较了5种培养液对接种在鸡胚肾细胞中的E.tenella子孢子的发育所起的作用。结果发现80%的Hank's平衡盐溶液加10%的水解乳蛋白、10%的胎牛血清可作为细胞生长培养液。接种子孢子后将胎牛血清和水解乳白蛋各减至5%，作为细胞维持液；或接种后，培养液换为90%的Eagle's基础培养液或HBSS 199培养液并均加5%水解乳蛋白和5%胎牛血清作为细胞维持液。后者卵囊产量比前者要多26%～57%。接种后加水解乳蛋白时，孵囊产量超过接种前后都加水解乳蛋白的培养系统的产量。谢明权等[9]发现α-MEM营养液作为E. tenella在体外细胞培养的培养基，卵囊产量最高。张健騑等[12]则认为相比Dalbecco改良的Eagle's 营养液，Eagle's基础营养液、Hank's盐平衡液、RPMI1640营养液的效果更好。谢宏料等[14]认为α-MEM培养基比1640培养基有显著增加第二代裂殖体和卵囊数量的效果，原因是α-MEM培养基中含有核糖核苷和脱氧核糖核苷，为球虫体外培养时的蛋白质代谢和核酸代谢提供了所需的基础物质，从而有利于虫体的发育。古少鹏等[15]对DMEM培养基和MEM 199培养基的成分进行比较发现，MEM 199培养基除了含有必须的氨基酸、碳水化合物和无机盐外，还含有其他物质，如脱氧核糖、核糖、硫酸腺嘌呤、ATP、腺苷一磷酸、胆固醇、鸟嘌呤等，而DMEM中没有。在子孢子入侵和发育过程中，ATP可为其提供能量，脱氧核糖和核糖可为其合成DNA提供组分，腺苷一磷酸可为其合成RNA提供组分，硫酸腺嘌呤、鸟嘌呤可为其核酸代谢提供组分，所以试验中用MEM 199培养基作为子孢子接种培养基更有利于虫体发育[8]。

血清含有细胞生长所需的基本营养物质，其中的激素与生长调节因子，具有促进细胞生长的作用；血清中还含有促进细胞黏附和铺展的因子，如纤维连接蛋白，对于贴壁依赖型细胞的粘附和铺展必不可少。谢明权等[9]发现α-MEM 营养液中添加0. 05ng/ mL的胰岛素，卵囊产量大大提高；张健騑等[13]认为牛血清比鸡血清效果好，尤其接种后1～4天用10%牛血清，5～7天改用5%鸡血清，其卵囊产量要远远大于只用鸡血清。若1～7天全用牛血清，产卵量比只用鸡血清及牛血清鸡血清混用的产量高[9]。古少鹏等认为肠上皮细胞培养用胎牛血清（FBS），FBS对肠上皮细胞生长有明显的促进作用，且呈剂量－效应关系[15]。但随着FBS量的增加，非肠上皮细胞数量也增多。同时发现在96h前用2.5%的FBS，96h后降为1%，在发育后期有较高的虫体感染率[16]。

Upton等[17]研究了在体外细胞培养中外源性物质对子孢子的活动性和发育过程所起的作用，发现白蛋白和胎球蛋白作培养液的补充物能够促进子孢子的运动和进入培养细胞。张健騑等[13]在体外培养条件下，测定了单项维生素（浓度为RPMI-1640标准量的5倍）对球虫卵囊的影响，结果显示球虫在只有氨基酸、葡萄糖的培养基中虽然也能发育，但其卵囊数远远低于营养成分完全的培养基。球虫的核酸代谢主要有嘌呤代谢和叶酸代谢，可通过培养基中添加叶酸的方式促进柔嫩艾美耳球虫子孢子在体外发育过程中的核酸代谢[13]。除叶酸外，VB6对卵囊的形成也有较高的影响，VB1也略能提高卵囊数。谢宏料，谢明权等[14]对叶酸、VB6、VB1的最适用量进行了探讨，发现当叶酸、VB6、VB1的含量为6 mg/L时，更有利于柔嫩艾美耳球虫子孢子在宿主细胞中的体外发育。

古少鹏等[16]认为胰岛素具有促进鸡原代肾细胞的生长和柔嫩艾美耳球虫第二代成熟裂殖体形成及提高卵囊数量的作用，他们在MEM 199培养基中葡萄糖添加量为3000 mg/L的情况下，添加了0.40 mg/L的胰岛素，目的是促进柔嫩艾美耳球虫子孢子在发育过程中能更好的发育。

3.5 pH值

古少鹏等[16]通过试验发现，培养基的pH值为7.4时最适宜卵囊的产生，而球虫对酸性培养基（低pH值）的耐受性比碱性培养基强。培养基的pH值在6.0～8.0的范围内，球虫能正常发育，产生卵囊，但卵囊产量却有高低之分，说明培养基的pH值是影响卵囊产量的主要因素之一[8]。

3.6 CO2和不同氧浓度对球虫体外培养的影响

Fukata等[18]研究了子孢子接种到体外培养细胞中在不同氧浓度下的发育情况，发现在5%CO2/95%空气条件下，相比有氧和厌氧条件下，子孢子进入细胞的数量多3～4倍。古少鹏等[15]研究发现，子孢子在8%～10%CO2条件下进入盲肠上皮细胞数多于5% CO2条件。

随着研究的深入，球虫的体外细胞培养技术已成为必备的技术之一，新的细胞系和检测技术的不断出现，将会使球虫的细胞培养体系更加完善和方便。国内外学者已进行了大量的研究，并在原代鸡肾细胞和鸡胚肾细胞中取得成功。但此类细胞非鸡球虫的真正宿主细胞，故所建立的细胞模型也无法准确反映球虫与宿主细胞的作用机制[16]。目前球虫的细胞培养还面临许多挑战，如目前球虫的传代细胞培养体系中的虫体不能完成整个生活史，这为研究球虫各个阶段的蛋白功能带来很大的阻碍。

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Culture method and infuencing factors of Eimeria tenella in vitro

Tian Yongqing1，Zhang Yan2， Zheng Mingxue2，Wang Lixia2
（1. Center of Animal Diseases Prevention and Control，Taigu 030800， Shanxi；2. College of Animal Science and Technology，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，Shanxi）

There are two approaches in vitro for chicken coccidian： chick embryo culture and cell culture for completing the endogenous development from sporozoites to oocysts，In vitro culturing has an important role and signifcance in the further studies of coccidia and coccidiosis. Both chick embryo culture and cell culture for in vitro coccidian culturing were analyzed and discussed in this paper in a attempt to provide technical supports for coccidiosis research.

chicken coccidia；chick embryo culture；cell culture；in vitro

S858.31

：A

：1005-944X（2014）05-0041-04

国家自然科学基金项目（31272536）

郑明学