核桃楸叶提取物不同极性部位的抗菌活性研究*

孙庆灵 霍金海 谢 健 王伟明

（黑龙江省中医药科学院·150036）

核桃楸（Juglans mandshurica Maxim）为胡桃科胡桃属落叶乔木，是东北著名的三大硬阔之一，为珍贵的用材树种。核桃楸的不同部位均有一定的药用价值：其未成熟果实或果皮（青龙衣），具有明显的镇痛，清热，解毒，止痢，明目的功效，用于镇痛、抗肿瘤等症；其种仁可以敛肺定喘，温肾润肠，用于体质虚弱，肺虚咳嗽，肾虚腰痛，便秘等症；其树皮可以清热解毒，用于细菌性痢疾，骨结核，麦粒肿等症[1-2]。

核桃叶的药理功能我国民间早有记载，能改善新陈代谢，促进肌体强壮[3-4]。核桃叶制剂对患维生素缺乏症、喉头炎、淋巴结、甲状腺肿大、结核病、黄疸病、妇科病、皮肤病等均有较好疗效[5-7]。叶的提取物对炭疽杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、链球菌、肺炎链球菌及伤寒杆菌、大肠杆菌、白喉杆菌有一定的杀菌作用[8-9]。

但核桃楸叶不同极性部位对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的抑制作用尚未见报道，本文对核桃楸叶提取物的不同极性部位进行体外抗菌试验研究，本实验采用平板打孔抑制法测定核桃楸叶提取物不同极性部位对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌三种供试菌的抑菌作用，以及其最低抑菌浓度。以期明确其有效部位，为充分利用核桃楸叶药用资源开发制剂，资源可持续利用奠定基础。

1 材料与试剂

1.1 实验材料

核桃楸叶于2012年09月采于哈尔滨市宾县，经黑龙江省中医研究院初东君主任药师鉴定为核桃楸(Juglans mandshurica Maxim) 的叶，阴干后粉碎。

供试菌种：金色葡萄球菌（Staphylococcus coureus），G+ (批号：ATCC25923)

大肠杆菌（Escherichia coli），G-(批号：ATCC25922)

绿脓杆菌（Pseudomonsa aeruginosa），G-(批号：ATCC27853)

菌种均由黑龙江省临床检验中心提供。

1.2 实验试剂

无菌生理盐水：氯化钠注射液（哈药集团制药六厂，批号：13030303-1）

MH（A）培养基（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20120519）

营养琼脂培养基（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20120602）

营养肉汤（NB）培养基（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：02-013）

乙醇，石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，均为分析纯；牛肉膏，蛋白胨，琼脂粉均为生化用品，纯净水为实验室自制。

1.3 实验仪器

BP211D型电子天平（Sartorius公司），RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），SHB-III型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），BCM-1000型生物洁净工作台（上海卓爵仪器设备有限公司），LDZX-75KB型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），BSC-250型培养箱（上海昂尼仪器仪表有限公司）。

2 实验方法

2.1 粗提物的制备

核桃楸叶粗粉1Kg，95%乙醇回流提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，减压回收至无醇味后加入蒸馏水，充分溶解后石油醚萃取3次，合并萃取液；再依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液减压浓缩，真空干燥（60℃），分别得石油醚萃取物15.23g，乙酸乙酯萃取物17.59g，正丁醇萃取物13.28g，将其配制成10mg/ml药液，经0.22μm滤膜过滤灭菌。

2.2 粗提物抗菌活性测定

样品：核桃楸叶水提物，石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物，正丁醇萃取物；菌株：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），大肠杆菌（Escherichia coli），绿脓杆菌（Pseudomonsa aeruginosa）。

2.3 培养基制备

2.3.1 MH（A）培养基的配制 取MH（A）培养基36.5g，加入1000mL蒸馏水中加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15min备用。

2.3.2 营养琼脂培养基的配制 取营养琼脂培养基38g，加入1000mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15min，在无菌操作台趁热将灭菌后培养基倒入培养皿中，自然冷却后，密封，置于4℃冰箱中备用。

2.3.3 营养肉汤（NB）培养基的配制 取营养肉汤（NB）培养基18g，加入1000mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15min，在无菌操作台趁热将灭菌后培养基倒入培养皿中，自然冷却后，密封，置于4℃冰箱中备用。

2.4 菌悬液的制备

取含有无菌生理盐水的离心管，用接种环在以培养好的划线菌种平面上刮取一定量的单个菌落，然后将接种环在生理盐水中冲洗干净，震荡均匀，以无菌生理盐水作对照，制成浓度大约在105-106cfu/mL的菌悬液。

2.5 提取物的抑菌试验

在洁净工作台内，用无菌棉签蘸取菌悬液在已配制好的MH（A）培养基表面均匀涂布，用以做灭菌处理的打孔器，在MH（A）培养基上打5个直径3mm的光滑小孔，其中1个小孔内打入无菌生理盐水作为空白对照，其余小孔分别加入不同浓度的供试样品，生理盐水作为阳性药对照组（直径3mm）。

2.6 最低抑菌浓度测定

测量各细菌的抑菌圈直径，取所测各不同浓度供试样品的抑菌圈直径的平均值，以大于空白的抑菌圈直径所对应的浓度(μg/mL)为最低抑菌浓度(MIC)，并对所得结果进行统计学分析，所有数据均采用平均值±标准差。

表1 核桃楸叶不同部位对不同细菌的抑菌效果

表2 核桃楸叶不同部位提取物对供试菌的最小抑菌浓度

3 结果与分析

3.1 提取物对供试菌的抗菌活性

核桃楸叶不同极性部位的抑菌效果见表1、表2，核桃楸叶提取物有机相部位对供试菌均有不同程度的抑制作用，抑菌圈比较结果显示，核桃楸叶提取物的抑菌效果：正丁醇相＞乙酸乙酯相＞石油醚相，水相无抑菌作用。

3.2 核桃楸叶不同极性部位的最低抑菌浓度

由表2可知核桃楸叶不同极性部位对供试菌的最低抑菌浓度，最低抑菌浓度的测定结果进一步说明，核桃楸叶提取物的有机相部位对供试菌有较好的抑菌作用。

4 讨论

孙墨珑[10]对核桃楸叶乙醇提取物进行分离，其有效成分5-羟基-1,4-萘醌(胡桃醌)、D-阿洛糖、5,8-二羟基-1, 4-萘醌、1,5-萘二酚、2,3-二氢苯并呋喃、7-甲氧基-1-四氢萘酮等对樟子松枯梢病菌和杨树叶枯病菌有抑制作用。本实验探究核桃楸叶提取物不同极性的抑菌作用，结果表明，核桃楸叶提取物不同极性部位除水相外均有不同程度的抑菌作用，其中有机相对革兰氏阴性菌大肠杆菌、绿脓杆菌有明显的抑菌作用，且随极性的增大抑制程度增强；而有机相对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抑制作用无明显差别。综合最低抑菌浓度和抑菌圈结果，明确了有机相部位为核桃楸叶抗菌的活性部位，说明其中存在有效的抗菌成分，接下来有必要对该部分做进一步的研究，最终分离出具有抗菌活性的单体成分。

体外抑菌实验结果表明核桃楸叶的药用价值是值得研究、开发、利用的。随着研究的深入，充分利用核桃楸叶药用资源，对保护严重不足的野生核桃楸资源以及其可持续发展具有重要的意义。

[1]翟梅枝，李晓明，林奇英，等．核桃叶抑菌成分的提取及其抑菌活性[J]．西北林学院学报，2003，18(4)：89—91．

[2]闻平，陈蕾．胡桃楸提取物对白色念珠菌生长的抑制作用[J]．中国微生态学杂志，2005，17(5)：335—338．

[3]宛蕾，陈秀芬，杜江．胡桃青皮抗炎及镇痛作用的研究[J]．中药药理与临床，1999，15(2)：29—30．

[4]陈奇．中药药理研究方法学[M]．人民卫生出版社，2006(Ⅱ)：264．

[5]周光宇．中国菌种目录[M]．化学工业出版社，生物、医药出版分社，2007：649—686．

[6]南京中医药大学．中药大辞典[M]．上海科学技术出版社，2006(下)：2183．

[7]贝时章．中国大百科全书[M]．中国大百科全书出版社，1980(Ⅱ)：1132．

[8]魏丽丽．核桃楸的药理作用研究[J]．黑龙江医药，2009，22(4)：532—534．

[9]姚振生，叶荷平，陈杰，等．野核桃叶提取物的体外抗菌作用[J]．江西中医学院学报，2000，13(3)：122—126．

[10]孙墨珑，宋湛谦，方桂珍．核桃楸叶乙醇提取物的抑菌活性及活性成分分析[J]．林产化学与工业2007，10（27）：81-84