中性粒细胞弹性蛋白酶基因突变致先天性粒细胞减少症2例并文献复习

侯 佳 王 莹 刘丹如 应文静 孙金峤 惠晓莹 王晓川

·论著·

中性粒细胞弹性蛋白酶基因突变致先天性粒细胞减少症2例并文献复习

侯 佳1王 莹1刘丹如 应文静 孙金峤 惠晓莹 王晓川

目的 总结2例中性粒细胞弹性蛋白酶(ELANE)基因突变的先天性粒细胞减少症患儿的临床特征、基因诊断及治疗方法，提高对该病的认识。方法 分析2例先天性粒细胞减少症患儿的临床表现，外周血中性粒细胞绝对计数(ANC)变化，中性粒细胞呼吸爆发功能及其体液、细胞免疫功能，对ELANE基因5个外显子及外显子相邻区域进行直接测序，分析突变位点，探讨其治疗方法。结果 ①例1生后3个月反复肺部感染，例2生后1个月反复规律性口腔黏膜溃疡。②2例外周血ANC持续低于1.5×109·L-1，例1最低为0.01×109·L-1，例2最低为0.09×109·L-1，2例均排除感染、自身免疫性疾病及血液系统疾病。免疫功能评价：2例中性粒细胞呼吸爆发功能均正常，IgG升高，细胞免疫功能正常。③血ELANE基因分析发现：例1存在c.661G>GT(p.G221GX)杂合无义突变，其父母基因检测未发现突变。例2存在c.377C>CT(p.S126SL)杂合错义突变，其胞姐和父母基因检测未发现突变。2个突变位点均为国内首次报道的已知致病突变，例1和2确诊年龄分别为3.25岁和13.5岁。④治疗：例2接受同胞造血干细胞移植成功，术后ELANE基因检测未发现突变，免疫重建成功；例1接受粒细胞集落刺激因子治疗。目前2例均在随访中。结论ELANE基因是先天性粒细胞减少症的重要致病基因，造血干细胞移植是先天性粒细胞减少症的有效根治手段。

先天性粒细胞减少症； 免疫缺陷病； 中性粒细胞弹性蛋白酶基因； 中性粒细胞绝对计数

1 临床资料

例1 女，3岁3个月。以“反复咳嗽近3年”为主诉于2013年10月24日入住复旦大学附属儿科医院(我院)。3月龄时因“支气管肺炎”入住外院 ，第1次发现中性粒细胞减少，中性粒细胞绝对计数(ANC) 0.43×109·L-1，抗感染治疗后ANC 0.81×109·L-1。6月龄时因“支气管肺炎、鹅口疮”入外院治疗， 查ANC 0.14×109·L-1。其后患儿多次因“咳嗽、发热”在当地医院就诊，2～3岁多次查ANC为0.02～0.15×109·L-1， Hb 93～104 g·L-1，予抗感染、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)治疗，曾口服利血生1个月。入我院前20 d患儿因“咳嗽3 d伴面色苍黄”入住当地医院，ANC(0.21～0.53)×109·L-1(图1)，予头孢哌酮/舒巴坦抗感染及G-CSF治疗无好转，转入我院。病程中患儿精神可，面色渐苍黄，无口腔溃疡和皮疹。

入院查体：发热，体温最高39℃，面色苍黄，扁桃体Ⅱ°肿大，右下肺呼吸音低，未闻及啰音，HR 124·min-1，心音有力，律齐，未及杂音。腹软，肝脾肋下未扪及肿大。入院诊断：肺炎，肺脓肿，粒细胞缺乏症。

辅助检查：图1显示多次查血常规ANC，仅1次ANC为 2.29×109·L-1(10月24日)。外周血涂片 ：中性粒细胞0.01、淋巴细胞0.57、单核细胞0.35、嗜酸细胞0.07。ESR 92 mm·h-1，CRP 126 mg·L-1。肝、肾功能正常。血、尿、痰及肺泡灌洗液培养均阴性；呼吸道病毒、支原体、衣原体、EBV、CMV及单纯疱疹病毒均阴性；血结核抗体和T-SPOT试验阴性；真菌葡聚糖、半乳甘露聚糖测定均正常。自身抗体阴性。免疫功能评估：中性粒细胞呼吸爆发功能：刺激指数103(参考值>100)；免疫球蛋白(3～6岁标准)：IgG 61.90 g·L-1(参考值4.95～12.74)、IgA 3.52g·L-1(参考值0.33～1.89)、IgM 2.20 g·L-1(参考值0.65～2.01)、总IgE 46.4 KUA·L-1(参考值<100)；CH50 53 U·mL-1(参考值23～46)、C3 1.32 g·L-1(参考值0.67～1.76)、C4 0.22 g·L-1(参考值0.1～0.4)；淋巴细胞亚群：CD3+0.44(绝对值1 841.16·μL-1)、 CD3+CD8+0.18(绝对值748.93·μL-1)、CD3+CD4+0.24(绝对值997.01·μL-1)、CD16+CD56+0.036(绝对值150.19·μL-1)、CD19+0.52(绝对值2 189.81·μL-1)。

图1 例1外周血常规WBC和ANC动态变化

Fig 1 The trends of peripheral WBC and ANC in case 1

骨髓细胞形态学：骨髓有核细胞增生活跃，粒红比0.91∶1。粒系增生减低，部分粒细胞可见中毒颗粒。红系增生减低，成熟红细胞中央淡染区增大。淋系、单核细胞与浆细胞比例增高。胸部CT：两肺炎症伴部分右肺实变、右下肺脓肿形成(图2)。纤维支气管镜：支气管炎性改变。

图2 例1胸部CT平扫所见

Fig 2 The chest CT scan of case 1

Notes The chest CT scan showed pneumonia, partial right pulmonary consolidation and the lower right pulmonary abscess

入院后先后予阿奇霉素、头孢哌酮/舒巴坦、美罗培南抗感染后体温正常，肺部情况好转，予G-CSF每次5～7.5 μg·kg-1，皮下注射4次，ANC仍在0.46×109·L-1(11月6日)。排除感染、自身免疫性、血液系统疾病造成的粒细胞减少，诊断为先天性中性粒细胞减少症。进一步行中性粒细胞弹性蛋白酶(ELANE)基因检测：1条等位基因第5号外显子661位碱基G突变为T，c.661G>GT，导致所编码的氨基酸在221位由甘氨酸突变为终止密码，p.G221GX，导致蛋白编码提前终止，为已知的致病突变(图3A)。患儿父母ELANE基因检测未发现突变(图3B、C)。目前患儿每周随访血常规，ANC 0.12～0.70×109·L-1(图1)。

图3 例1及其父母ELANE基因检测

Fig 3ELANEgene mutation detection in case 1 and her family

Notes c.661G>GT(p.G221GX) mutation was found in patient (A). No mutation was found in her father (B) and mother (C)

例2 女，13岁6个月。因“反复口腔溃疡、发热12年”主诉于2012年12月24日入我院。患儿系G2P2，足月顺产，出生体重3.5 kg，无窒息抢救史。生后1月龄因发热查血常规发现中性粒细胞减少，每20～30 d出现1次口腔溃疡伴体温39～40℃，4～5 d后愈合，不伴咳嗽，使用退热药和抗生素治疗症状好转。5岁时曾患“病毒性脑炎”，9岁时因左侧颈部化脓性淋巴结炎手术。入我院前2个月，出现发热就诊于当地医院,诊断“肺炎”,血常规：WBC 2.8×109·L-1，ANC 0.17×109·L-1，CRP 192.5 mg·L-1，予哌拉西林/舒巴坦、头孢曲松治疗后体温正常，肺炎好转，多次血常规均显示WBC和ANC降低(图4)，转至我院。

患儿父母、姐姐(19岁)身体健康。家族中无类似病史。

入院查体：神志清楚，左侧颈部可扪及1.0 cm×1.0 cm淋巴结，无触痛，无粘连。口腔舌部左侧和咽峡部各见一处溃疡。心肺查体未见异常，肝脾未扪及肿大。以粒细胞缺乏症、口腔溃疡收入院。

辅助检查：血常规WBC 1.7×109·L-1，ANC 0.09×109·L-1，CRP<8 mg·L-1，ESR 77 mm·h-1。肝肾功能正常。病原学：血培养阴性，EBV、CMV阴性，PPD试验阴性。自身抗体阴性。免疫功能评价：中性粒细胞呼吸爆发功能：刺激指数134；免疫球蛋白(12～14岁标准)：IgG 24.96 g·L-1(参考值6.98～14.26)、IgA 3.19 g·L-1(0.92～2.50)、IgM 3.60 g·L-1(参考值0.56～2.16)、总IgE 26 KUA·mL-1(参考值<100)，C3 1.32 g·L-1，C4 0.31g·L-1，CH50 56 U·mL-1；淋巴细胞亚群：CD3+0.75(绝对值766.22·μL-1)，CD3+CD8+0.36(绝对值365.94·μL-1)，CD3+CD4+0.35(绝对值357.82·μL-1)，CD16+CD56+0.082(绝对值83.89·μL-1)，CD19+0.16(绝对值165.48·μL-1)。骨髓细胞形态学检查：骨髓增生活跃，粒细胞缺乏。

图4 例2外周血常规WBC和ANC动态变化

Fig 4 The trends of peripheral WBC and ANC in case 2

患儿反复口腔溃疡伴有慢性严重ANC减少，排除感染、自身免疫性疾病及血液系统疾病。ELANE基因检测：1条等位基因第4号外显子377位碱基C突变为T, c.377C>CT，导致所编码的氨基酸在126位由丝氨酸突变为亮氨酸, p.S126SL, 编码区域点突变(错义突变)，为已知的致病突变(图5A)。诊断为先天性中性粒细胞减少症。先后给予2剂IVIG 400 mg·kg-1输注, 2013年1月4日出院时ANC 0.76×109·L-1(图4)。

患儿父母ELANE基因检测未发现突变(图5B,C)。患儿姐姐ELANE基因检测正常(图5D)，且与其HLA配型高分辨10/10相合，2013年6月21日外院行同胞全相合造血干细胞移植(HSCT)。移植后+10 d血小板植活，+15 d白细胞植活，+40 d骨髓穿刺检查骨髓均为供者来源。移植术2个月检测患儿ELANE基因(图5E)：未检测到基因突变，第377位碱基为正常序列C，造血干细胞移植后免疫重建成功。但患儿移植术后发生CMV感染、脑膜脑炎，目前仍在随访中。

图5 例2患儿移植前后及其家庭成员ELANE基因检测

Fig 5ELANEgene mutation detection in case 2 family

Notes c.377C>CT(p.S126SL) mutation was found in patient (A,reverse sequence). No mutation was found in patient's mother (B,reverse sequence) , father (C) and sister (D). The patient presented with normal ELANE gene after hematopoietic stem cell transplantation(E,reverse sequence)

2 讨论

先天性粒细胞减少症的特征为基因缺陷造成慢性粒细胞减少，伴有或不伴有免疫或造血系统外异常。外周血ANC随年龄而异，国内外关于粒细胞减少症有明确的定义[1]：新生儿ANC<2.5×109·L-1、～12个月婴儿ANC<2×109·L-1、>1岁ANC<1.5×109·L-1。中性粒细胞减少持续超过3个月则为慢性粒细胞减少症。自20世纪90年代早期开始，尤其最近10年，陆续发现先天性粒细胞减少症的数种分子基础和致病基因，从而对该疾病有更深入的认识和研究。

先天性粒细胞减少症罕见，相关流行病学数据十分有限。伊朗报道其患病率为0.77/100万[2]，法国的一项人群研究报道其患病率约6.2/100万[3]，两者差异较大，且都不包括特发性粒细胞减少者。2003年一项纳入美国、加拿大、澳大利亚及欧洲(不包括法国)近7亿人群的调查发现其患病率为0.7/100万，如包括特发性粒细胞减少者，则患病率约1/100万[4]。国内至今仅有1例ELANE基因确诊的先天性粒细胞减少症病例报道[5]，尚无患病率的数据，临床上对该病的认识亦十分有限。

先天性粒细胞减少症可根据ANC水平不同，分为轻度(ANC 0.5～1.5 ×109·L-1)和重度(ANC <0.5×109·L-1)。先天性粒细胞减少症的临床特征为感染。感染的风险与循环中性粒细胞数量成反比，当ANC>1.0×109·L-1，感染风险小; ANC<0.2×109·L-1时，感染风险极大[6]。感染的风险亦与粒细胞减少持续时间有关，持续数周后真菌感染风险增加。感染的部位多变，以皮肤黏膜、耳、鼻、喉及肺部最为常见。本文报道的2例患儿表现典型，例1累及呼吸道，反复肺部感染，例2为反复口腔黏膜溃疡。口腔疾病几乎见于所有>2岁粒细胞减少症患儿，表现为侵蚀性、出血性和疼痛性牙龈炎，伴有舌部、颊黏膜溃疡[7]。有时可出现广泛胃肠道病变，导致腹痛和腹泻，影像学类似克罗恩病，与细菌性肠炎相关。粒细胞减少症患儿感染症状可以不典型，仅局部炎症，无脓，无坏死倾向；重者发生致命性化脓性细菌感染。病原方面，以细菌感染最常见，包括：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、链球菌、肠球菌、肺炎球菌，绿脓假单胞菌等其他革兰阴性杆菌；其次为真菌感染，主要为念珠菌和曲霉菌。

病史回顾和体格检查可以揭示粒细胞减少的病因，需鉴别病毒感染、恶性血液病、医源性因素，或自身免疫性疾病。在不紧急情况下，观察数周以确定粒细胞减少是持续性还是周期性。理想的确诊粒细胞减少症需每周行3次血常规检查，持续6周。有必要行骨髓检查除外恶性血液病，评估骨髓细胞成熟，检测确切病因。早幼粒细胞阶段粒细胞成熟障碍常常伴有骨髓嗜酸粒细胞增多和单核细胞增多。骨髓形态学上，不同病因没有独特的表现。本文2例患儿均排除上述继发性因素，需考虑基因缺陷导致的先天性粒细胞减少症。

先天性粒细胞减少症包括2种亚型，严重持续性先天性粒细胞减少症和周期性粒细胞减少症，2种亚型可被视为同种疾病谱的一部分。严重持续性先天性粒细胞减少症ANC常<0.2×109·L-1，单核细胞增多，嗜酸细胞增多，高丙种球蛋白血症，有时伴有炎症性贫血，在早幼粒细胞阶段粒细胞成熟障碍，常在6月龄前诊断。周期性中性粒细胞减少症的外周血ANC呈现周期性波动，平均21 d为一个周期[8]，一般症状较轻，通常于2岁以后诊断，主要临床表现为反复急性口腔疾病，如口疮和口腔溃疡。骨髓表现有时完全正常。本文报道的2例患儿ANC数量持续重度减少，无周期性变化，尽管粒细胞数量减少，但中性粒细胞呼吸爆发功能正常，刺激指数均>100。外周血单核细胞增多，IgG升高，T细胞、B细胞和NK细胞均正常，符合ELANE基因突变所致严重先天性粒细胞减少症的特点。本文2例患儿起病早，分别在生后3和1月龄即发现粒细胞减少，但确诊年龄分别为3岁3个月和11岁6个月，较国外文献报道晚，分析原因是该病罕见，临床医生对该病的认识不足，缺乏诊断经验和条件。

先天性中性粒细胞减少症是一种罕见的原发性免疫缺陷病，为单基因遗传，X连锁或常染色体隐性或显性遗传。ELANE基因突变是已知的先天性粒细胞减少症最常见的病因，呈常染色体显性遗传或散发，见于50%～60%的患者[9～11]，在周期性粒细胞减少症患者的家系和严重持续性先天性粒细胞减少症患者中都发现ELANE基因突变[12, 13]。ELANE基因突变的先天性粒细胞减少症没有造血系统外病变，适应性免疫正常。ELANE基因位于染色体19p13.31，由5个外显子组成，编码218个氨基酸的中性粒细胞弹性蛋白酶。该酶是一种髓系细胞特异性丝氨酸蛋白酶，在中性粒细胞分化的早幼粒阶段产生，存在于成熟中性粒细胞的初级颗粒中，可降解多种细菌蛋白，在先天免疫防御中发挥重要作用。迄今已报道70多种ELANE基因突变类型(http://rapid.rcai.riken,jp/RAPID)，尚未发现基因型与表型间的内在联系，同一突变类型可见于周期性或严重持续性先天性粒细胞减少症的患者。但研究报道ELANE基因Gly185Arg突变患者往往临床症状非常严重，需要大剂量G-CSF治疗，转换成白血病的风险特别高[9, 14]。2013年国内报道1例ELANE基因c.164G>A突变[5]，本文报道2例ELANE基因突变分别位于第5号外显子c.661G>GT的无义突变和位于第4号外显子c.377C>CT的错义突变。2例均为国内首次报道的已知致病突变。ELANE基因突变导致错误的蛋白折叠，继而引发“未折叠蛋白反应”，增加分子伴侣、 内质网相关的降解和促凋亡基因的转录，可能是导致细胞发生凋亡的病理机制[15, 16]。

HSCT可永久性纠治粒细胞减少，也是接受G-CSF治疗后持续严重感染患者的唯一选择。先天性粒细胞减少症患者HSCT的指征包括：对G-CSF无反应(>50 μg·kg-1·d-1)或发生骨髓增生异常/白血病。ELANE基因Gly185Arg突变的患者也应进行HSCT。对无恶变的患者，移植后效果理想，无病生存率达75%，而发生骨髓增生异常或白血病的患者移植后无病生存率分别为57%和27%[19]。本文例2接受同胞HSCT，移植手术后免疫重建成功，目前仍在随访中。

先天性粒细胞减少症虽然罕见，但随着对其临床特征、致病基因和治疗手段的不断认识，尽早明确诊断、预防和控制感染、检测G-CSF治疗相关的恶变风险以及采用HSCT治疗方法对改善患者的预后将起重要作用。

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(本文编辑：丁俊杰)

Two Chinese cases of congenital neutropenia caused by ELANE gene mutations and literature review

HOU Jia1，WANG Ying1，LIU Dan-ru，YING Wen-jing，SUN Jin-qiao，HUI Xiao-ying，WANG Xiao-chuan

(1 Department of Clinical Immunology, Children's Hospital of Fudan University, Shanghai 201102, China; 1 Equal contribution)

WANG Xiao-chuan，E-mail:xchwang@shmu.edu.cn

ObjectiveTo identifyELANEgene mutations in 2 Chinese cases with congenital neutropenia and to better understand the clinical characters, diagnosis and treatment of this rare disease.MethodsClinical data of the two cases with congenital neutropenia were collected, including clinical manifestations, trends of the absolute neutrophil count (ANC), and immunological function. All 5 exons and flanking regions ofELANEgene were sequenced for the two cases and their families.ResultsTwo cases were diagnosed as neutropenia at the age of 3 months and 1 month respectively, characterized with recurrent infections, including recurrent pneumonia in one case and oral mucosa ulcer in the other. Two cases presented with persistent neutropenia with the ANC less than 1.5×109·L-1, the lowest ANC reached 0.01×109·L-1for case 1 and 0.09×109·L-1for case 2, respectively. Screening of blood serum and bone marrow was performed to exclude pathogenic infection, autoimmune disease and hematological malignancies. The respiratory burst of neutrophils and cellular immune function of both cases were normal, except for the elevated serum IgG level. Case 1 had c.661G>GT(p.G221GX)heterozygous nonsense mutation inELANEgene, case 2 had c.377C>CT(p.S126SL)heterozygous missense mutation. No mutation was found in their family members. Case 2

hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and presented with normalELANEgene afterwards, case 1 was treated with G-CSF, both were followed up. ConclusionELANEgene is the critical pathogenic gene for congenital neutropenia. HSCT is the effective radical treatment for this rare disease.

Congenital neutropenia; Immunodeficiency;ELANEgene; Absolute neutrophil count

国家自然科学基金：81172877，81373221

复旦大学附属儿科医院临床免疫科 上海，201102；1 共同第一作者

王晓川，E-mail:xchwang@shmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-5501.2014.03.003

2014-03-17

2014-05-02)