生物膜中白念珠菌的耐药性研究

张 慧， 孙红英

生物膜中白念珠菌的耐药性研究

张 慧， 孙红英

生物膜； 白念珠菌； 耐药机制

白念珠菌（Canida albicans）是人类最常见的条件致病真菌，健康者带菌率以口腔最高，约80%［1］。当机体免疫力下降或使用免疫抑制剂时，白念珠菌可导致严重的感染性疾病，在美国医院感染中列第4位，其病死率为30%～70%［2-3］。研究发现，在难治性白念珠菌感染的病灶中大多存在生物膜。自然界中99%微生物以生物膜的形式存在，65%人类感染性疾病与生物膜相关［4］。

白念珠菌生物膜是单个细菌细胞黏附于载体或有机体表面形成的三维立体结构，是由细菌细胞外基质包裹而成的菌落。生物膜作为一种屏障，使其内部的菌落得以逃避机体防御系统的攻击，躲避抗菌药物的杀伤作用，导致久治不愈及细菌耐药性的出现［5］。明确生物膜内白念珠菌的耐药机制，对预防生物膜形成，治疗生物膜内白念珠菌导致的感染性疾病均具有重大意义。

一、耐药机制研究

（一）白念珠菌生物膜对药物敏感性的影响Hawser等［6］研究发现，使生物膜内细菌减少50%时所需的药物浓度是浮游菌的5～8倍，生物膜内白念珠菌对于真菌药物的敏感性是浮游菌的1／30～ 1／20 000。

目前，生物膜内白念珠菌对药物敏感性的研究主要采用的XTT钠盐减低法，是一种简单、高效而经济的标准检测方法。Ramage等［7］利用XTT钠盐减低法证实，与浮游菌相比，即使两性霉素B的浓度提高1～32倍，生物膜内白念珠菌对药物仍不敏感，且两性霉素B浓度达到最大（16 mg／L）时也不可能完全去除生物膜。Konopka等［8］研究结果显示氟康唑的浓度达到100 mg／L，生物膜内白念珠菌的活性下降仅20%左右。Lamfon等［9］证实生物膜内白念珠菌对氟康唑的耐药性是浮游菌的1 000多倍。生物膜的形成使药物敏感性明显下降，故研究耐药性机制颇为重要。

（二）生物膜中白念珠菌耐药机制研究现状 目前，生物膜内白念珠菌耐药机制主要包括生物膜中白念珠菌细胞的密度、药物靶点的过度表达、药物外排泵基因的表达、细胞外基质等多种因素［10］。

1．细胞的密度：Perumal等［11］基于细胞密度影响生物膜耐药性的假设，通过实验证实了高密度的细胞量对生物膜中白念珠菌的药物敏感性具有显著的意义。Seneviratne等［12］同样证实了这一点，细胞密度降低了生物膜内白念珠菌对酮康唑和5氟胞嘧啶的敏感性。

但细胞密度只是生物膜内白念珠菌复杂耐药机制的一个方面，生物膜内白念珠菌的耐药机制包含多方面，相互交叉。

2．药物靶点的过度表达：唑类药物对白念珠菌具有抑菌作用，存活的菌群可发生自然选择，导致生物膜内细菌对高浓度唑类药物耐药。Nailis等［13］在一项药物特异性转录反应试验中，利用实时定量RT-PCR检测到在高浓度氟康唑作用下基因ERG1、ERG3、ERG11和ERG25表达上升；在两性霉素B作用下基因SK N1、KRE1和ERG1表达上升。成熟和未成熟生物膜内白念珠菌在氟康唑的作用下，编码麦角固醇生物膜合成酶相关的基因ERG1、ERG3、ERG11、ERG25表达水平均有所升高，导致生物膜内白念珠菌对氟康唑产生耐药性。

Yu等［14］发现成熟生物膜内白念珠菌在法尼醇（白念珠菌的一种群体感应分子，是麦角固醇的前体物质）作用下表现出对氟康唑的敏感性，RT-PCR检测结果显示，在法尼醇作用下ERG1、ERG3、ERG6、ERG11和ERG25表达水平的明显下降，说明麦角固醇的生物合成可阻止法尼醇的作用，而EGR基因表达水平的提高可增加生物膜内白念珠菌的耐药性。

3．外排泵基因的表达：药物外排泵基因的表达上升被认为与生物膜内白念珠菌的耐药性密切相关。编码多重耐药性转运体的基因，MDR1、CDR1和CDR2在耐氟康唑类药物的未成熟生物膜内白念珠菌中表达水平增高，但是这只存在于未成熟生物膜内白念珠菌中，在成熟生物膜（大于48 h）内白念珠菌中敲除上述单个基因或联合敲除2个或以上基因，高水平的耐药性未受到任何影响。

4．细胞外基质：和细菌生物膜类似，白念珠菌生物膜的细胞外基质在维持生物膜结构的完整性及药物敏感性方面具有重要的作用［15］。可溶性β-1，3葡聚糖是白念珠菌生物膜胞外基质的重要组成部分，可与唑类和多烯类药物发生螯合作用，进而阻止药物的渗入，引起耐药性反应［16-18］。

与浮游菌相比，生物膜内白念珠菌可产生更多的可溶性β-1，3葡聚糖，培养浮游菌时加入外源性可溶性β-1，3葡聚糖可明显提高生物膜内白念珠菌对氟康唑的最低抑菌浓度，而在生物膜中加入葡聚糖酶可提高对唑类药物的敏感性［19］。

总之，生物膜内白念珠菌耐药机制复杂多样，但目前仍存在很多有争议的地方，如Yu等［14］发现在法尼醇（麦角甾醇的前体）的作用下成熟生物膜内白念珠菌对氟康唑的敏感性增加。然而麦角甾醇并不参与棘白菌素抑制成熟生物膜中真菌细胞壁成分β葡聚糖的合成。目前，仍有很多未知的生物膜内白念珠菌的耐药机制。

二、生物膜中耐药株对耐药性的影响

（一）白念珠菌生物膜中耐药株的存在 近年研究报道，除上述生物膜内白念珠菌的耐药机制外，还存在一些高度耐药的细胞亚群。LaFleur等［20］提出在真菌生物膜中存在一种高度耐药的细胞亚群，有趣的是这种细胞亚群仅存在于成熟生物膜（大于48 h）中，在浮游菌中未检测到，称之为耐药株（persister），是表型的变异而非基因突变，仅占细胞总量的1%左右。耐药株受到生物膜中细胞外基质的保护作用，在药物浓度下降后会重新形成生物膜。在慢性感染迁延不愈中耐药株具有重要的作用。

同时研究发现，缺少Efg1p、Cph1p或Mkc1p的白念珠菌可形成缺陷型生物膜，即使efg1Δ／cph1Δ双突变株仍可产生耐药株，即耐药株的出现与生物膜的复杂结构无关，黏附于载体表面就足以产生耐药株［20］。有学者通过体外建立细菌生物膜的数字化模型发现，生物膜越厚，所产生的耐药株数量越多，在缺乏营养物质的区域，活细胞无法生长但可自发地转变为耐药株，在浅层生物膜中细胞的生长速度超过了其转变为耐药株的速度，即耐药株在生物膜中的分布是不均一的，真菌生物膜中是否存在这一现象需进一步验证。

Al-Dhaheri等［21］选用6种不同的念珠菌：白念珠菌GDH2346、白念珠菌SC5314、光滑念珠菌AAHB12、热带念珠菌AAHB73、近平滑念珠菌AAHB4479和克柔念珠菌，以两性霉素B为抗菌药物，结果显示只有克柔念珠菌、近平滑念珠菌生物膜中发现耐药株，而白念珠菌SC5314和光滑念珠菌生物膜中未发现耐药株，同时该实验无法确定白念珠菌GDH2346生物膜中是否存在耐药株。这说明耐药株在念珠菌生物膜中并非普遍存在，在野生型白念珠菌生物膜中是否普遍存在这一问题，尚无研究证实。

（二）生物膜中耐药株的产生 生物膜中耐药株的形成已成为其多重耐药性研究的焦点，但耐药株形成的具体机制尚不清楚。

白念珠菌生物膜中耐药株的形成与生物膜复杂的结构无关，而与白念珠菌对载体的黏附性密切相关。白念珠菌细胞从感应载体到附着在载体表面开始，细胞表面的黏附分子与附着表面的细菌特异性结合，促进耐药株的形成。已有研究表明，参与白念珠菌黏附过程的信号通路主要有MAPK和Rasc AMP两条信号传导途径［22］。

研究白念珠菌黏附过程的重要信号传导途径，有望找到耐药株形成的关键基因，进而找到新的药物治疗靶点，可以解决生物膜内白念珠菌多重耐药性的种种难题。

（三）生物膜中耐药株的耐药性 阻断生物膜中耐药株的生成可能成为一种解决生物膜内白念珠菌高度耐药的重要途径之一，目前关于耐药株耐药性具体机制的观点上不统一。

1．超氧化物歧化酶与活性氧自由基对耐药株耐药性的影响：Bink等［23］发现高浓度的咪康唑可使白念珠菌野生株生物膜中的耐药株数量占细胞总量的1%～2%，超氧化物歧化酶（superoxide dismutases，Sods）在白念珠菌生物膜中受基因SOD的编码，对活性氧自由基（ROS）的降解具有重要的作用，在咪康唑的作用下Sods可上调基因SOD的表达水平，研究中使用Sods的抑制剂N，N-二乙基二硫代氨基甲酸（N，N’-diethyldithiocarbamate，DDC）可对咪康唑耐药的耐药株减少为原来的1／18，而ROS水平提高。

Dörr等［24］证实SOS基因系统可诱导耐药株的形成，当菌体DNA受到严重损伤、处于危急状态时Rec A蛋白被激活，SOS基因表达，修复损伤的DNA，即SOS修复，使菌体在抗菌药物作用下能够继续存活，成为耐药株，是耐药株形成的重要机制，但不同抗菌药物对耐药株形成的机制并不相同。Lex A蛋白是主要的SOS反应调节剂，作为转录阻遏蛋白行使功能直至DNA损伤激活Rec A，Rec A介导Lex A自我消化，从而允许SOS基因表达。Wu等［25］在氧应激对耐药株耐受性影响的实验中发现lex A3变异株缺乏SOS应激反应时耐药株的耐药性下降，证实了Lex A蛋白在SOS反应中的作用。

研究发现亚抑菌浓度抗菌药物治疗可产生ROS，ROS直接损伤DNA，激活SOS反应，导致耐药株的产生。van der Veen等［26］也指出SOS反应受ROS的影响。由此可见，ROS及SOS反应在真菌生物膜耐药株形成过程中具有重要作用，但具体研究机制目前鲜见报道。

2．组蛋白脱乙酰基酶抑制剂对耐药株耐药性的影响：组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylase，HDA）抑制剂，如丙酸、曲古抑菌素A和丁酸，可诱导哺乳动物细胞中的细胞凋亡。Al-Dhaheri等［27］用荧光素二醋酸标志生物膜，发现在两性霉素B的作用下成熟生物膜中仍存在少量活细胞，加入HDA抑制剂后两性霉素B的药效明显提高，生物膜内真菌对两性霉素B的敏感性也提高，镜下观察到耐药株出现凋亡，但具体机制尚不清楚。HAD抑制剂引起真菌生物膜中耐药株凋亡，可能成为抗耐药株的有效药物。

3．生物膜中分子间的相互作用：生物膜中耐药株并非独立存在，单独发挥耐药性。Balaban等［28］发现在生物膜中，耐药株和非耐药株共同存在，彼此之间相互作用，形成一个复杂的网络系统，促进或阻断某一分子的活性，可能对耐药株的耐药性产生抑制作用，因此，生物膜中分子之间的相互作用有望成为探寻新型治疗方法的途径之一。

三、总结

综上所述，生物膜内白念珠菌的耐药机制包括生物膜中真菌细胞的密度、药物靶点的过度表达、药物外排泵基因的表达、细胞外基质等多种因素，是多种机制相互作用的结果。而生物膜中耐药株的提出，使耐药机制更加复杂。然而并不是所有生物膜中的白念珠菌都可产生耐药株，因此，白念珠菌生物膜中耐药株的产生量将成为其耐药性大小的决定因素之一［21］。

研究发现在癌症患者中口腔白念珠菌感染时间越长，分离得到的耐药株数量越多［29］。在错综复杂的耐药机制中，生物膜内白念珠菌耐药株的发现对其耐药机制提供了新的研究热点和治疗策略，白念珠菌感染导致的慢性炎症性疾病往往迁延不愈，是否与生物膜内白念珠菌耐药株的产生相关，目前尚无法定论，因此，明确生物膜中白念珠菌耐药株形成的机制及耐药机制对寻找新型治疗药物具有重大意义。但是如何从白念珠菌生物膜中快捷分离到高数量的耐药株，及对耐药株形成及耐药性机制尚需进一步研究。

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Antibiotic resistance ofCandida albicansin biofilm

ZHANG Hui，SUN Hongying．
（Department of Dentistry，Huashan Hospital，Fudan University，Shanghai200040，China）

R378

A

1009-7708（2014）04-0361-04

2013-09-23

上海市科委西医引导类基金（编号：134119a8700）；2013年复旦大学第十三批研究生创新基金。

复旦大学附属华山医院口腔科，上海 200040。

张慧（1986—），女，在读硕士，主要从事口腔白念珠菌的研究。

孙红英，E-mail：huashan110926＠163．com。