中枢神经系统隐球菌感染发病的分子机制

曹亚辉， 王 璇， 朱利平

中枢神经系统隐球菌感染发病的分子机制

曹亚辉， 王 璇， 朱利平

隐球菌； 中枢神经系统； 分子机制； 血-脑脊液屏障

中枢神经系统隐球菌感染在中枢神经系统真菌感染中最为常见，且病死率长期以来居高不下，目前其发病机制尚不十分明确。因隐球菌主要通过血运播散，透过血-脑脊液屏障进入中枢神经系统，因此如何透过血-脑脊液屏障是其致病机制的研究热点。血-脑脊液屏障是介于血液和脑组织之间紧密连接的网状结构，由脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞共同组成。这种特殊结构允许疏水性物质，如O2、激素、CO2等扩散至脑内，却限制微生物及大分子物质通过，以此来调节血源性物质的通透性，维持中枢神经系统微环境的稳定。近年来随着对隐球菌透过血-脑脊液屏障机制研究的不断深入，已初步阐明其跨细胞膜转运机制、“特洛伊木马”机制及细胞旁扩散转运机制。现就其跨越血-脑脊液屏障的分子机制作一综述。

一、跨细胞膜转运机制

目前，对隐球菌跨细胞膜转运机制的研究最为深入，体外血-脑脊液屏障模型及活体动物实验均表明，隐球菌可通过对脑微血管内皮细胞的黏附、融合，进而穿越微血管内皮细胞进入中枢神经系统。这一过程首先涉及隐球菌对脑微血管内皮细胞的黏附。研究人员通过透射电子显微镜发现，当隐球菌和脑微血管内皮细胞在37℃恒温孵育时，隐球菌首先黏附于微血管内皮细胞表面，随后进入内皮细胞，诱导其细胞骨架重组，形成微绒毛突起，该过程在隐球菌与之接触1 h内即可完成。随后，隐球菌寄生在脑微血管内皮细胞胞质内，一旦宿主细胞骨架重组完成，隐球菌便从内皮细胞对侧表面逸出，该过程只引起轻微的细胞损伤而不会破坏其完整性［1］。另有学者应用活体实时成像技术动态观察隐球菌跨越脑微血管内皮细胞的全过程。他们首先对大鼠微血管系统注射荧光染料，使之呈现红色标记；隐球菌予以绿色荧光素标记，并将标记的隐球菌从尾静脉接种于大鼠，6 h后可以看到隐球菌逐渐黏附于脑微血管管壁，进而与之融合，并缓慢穿越血管内皮系统，透过血-脑脊液屏障［2］。这一实验进一步证实了该跨细胞膜转运机制的存在。同时，研究人员在探讨人免疫缺陷病毒（HIV）对隐球菌导致人脑微血管内皮细胞改变的影响时，发现HIVgp41胞外域能明显增强隐球菌所致人脑微血管内皮细胞骨架蛋白（包括肌动蛋白和细丝蛋白）的改变，使得这两种蛋白的丝状排列扭曲，纹理稀疏，且通透性增强，可使隐球菌与脑组织的结合力增强2．5倍［3］。这些均证实了隐球菌以改变脑微血管内皮细胞骨架的方式透过血-脑脊液屏障。

进一步研究发现隐球菌黏附、融合人脑微血管内皮细胞，需要通过脑微血管内皮细胞表面表达的CD44受体介导［4］。有学者通过CD44基因敲除小鼠感染隐球菌，结果发现野生型小鼠（CD44+／+）在感染后38 d内全部死亡，而CD44基因敲除小鼠感染后在观察时间内仍然存活。提示CD44受体参与隐球菌与血管内皮细胞的黏附作用。另有研究发现隐球菌可产生透明质酸（HA），HA为CD44的配体，可与CD44特异性结合，并诱导其下游信号转导，引起细胞骨架重组，该信号转导主要由蛋白激酶A-α（PKA-α）介导，脂筏内吞通道也参与其中［5］。应用CD44抗体阻断这一信号通路时，隐球菌的黏附能力和中枢神经系统的菌体载量会明显下降，进一步验证了CD44介导的跨细胞膜转运作用。近年也有研究显示隐球菌除产生HA加强与宿主细胞的黏附外，还可以产生磷脂酶B1，与内皮细胞的脂类介质相互作用，从而使GDP-Rac1活化为GTPRac1，继而与转录因子3（STAT3）通路相联系，诱导细胞溶解及骨架重组，促进内皮细胞对隐球菌的内吞作用［6］。该黏附、融合过程还涉及到S100A10蛋白［7］，S100A10蛋白主要表达于动物的肺、肾脏及血管内皮细胞，依赖胞膜表面的离子通道（如钙离子通道）和蛋白受体参与细胞内外物质交换。有研究人员在抑制S100A10蛋白的表达后发现，微血管内皮细胞内钙离子浓度明显下降，细胞对隐球菌的内吞作用降低，从而减少内皮细胞与隐球菌的融合与内吞；而当隐球菌与正常内皮细胞接触及融合时，通过光谱技术可以观察到S100A10蛋白明显上调，成为跨细胞膜转运机制的又一佐证。

除此之外，研究表明人脑内富含的肌醇不仅参与神经应答和反馈，也可参与跨细胞膜转运机制。一方面肌醇通过直接增加HA的产生，来增强隐球菌对内皮细胞的黏附性；另一方面，其可通过剂量依赖的形式促进隐球菌跨膜过程，即隐球菌依赖肌醇转运蛋白获取肌醇作为碳源，为自身生长提供物质条件。有研究发现，当突变菌株缺少Itr1a和Itr3c这2种主要的肌醇转运蛋白基因时，隐球菌透过血-脑脊液屏障的效率降低70%［8］。而近期一项体外实验发现荚膜本身形成的特定形态，也会增加隐球菌与宿主内皮细胞的黏附力，从而在跨细胞膜转运机制方面起到一定的作用［9］。新型隐球菌可以衍生出直径为100～200 nm的微囊泡（Cryptococcusneoformans-derived microvesicles，Cn MVs），这些Cn MVs可以诱导人脑微血管内皮细胞表面脂筏成分的重新分配，促进细胞与细胞间的融合。另外用14-3-3-GFP（绿色荧光蛋白融合剂）标记Cn MVs，可以发现Cn MVs分布在新型隐球菌诱导的囊性病变的中心区域及周围，并且脑实质及脑脊液中的绿色荧光越高，小鼠脑内的真菌载量越高，提示隐球菌衍生的微囊泡可以促进隐球菌跨越血-脑脊液屏障并在感染的损伤部位积聚。

二、“特洛伊木马”机制

隐球菌被吞噬细胞（如巨噬细胞或单核细胞）吞噬后可启动多种机制使其长期在吞噬细胞中存活，并以此为载体或保护壁垒穿越血-脑脊液屏障造成中枢神经系统感染，该机制又被称为“特洛伊木马”机制。该机制在一些体内和体外实验中得到了支持。有研究人员将隐球菌与骨源性单核细胞（BMDM）共孵化，然后注入大鼠尾静脉，并测其感染后脑组织中的菌体载量，结果表明隐球菌在大鼠脑组织中的菌落数（CFU）是未与BMDM共孵化对照组的4倍；与此同时，当注射氯膦酸盐使单核吞噬细胞耗竭后，隐球菌脑膜炎的严重程度有所降低，中枢神经系统的真菌载量降低近40%［10］，这提示单核巨噬细胞在隐球菌播散和入侵中枢神经系统过程中起着一个载体作用。另有研究发现当小鼠感染隐球菌后，肺吞噬细胞内隐球菌的数量在8 h可出现高峰，但7 d后胞内的隐球菌数量反而较胞外增多，中枢神经系统菌量增加更为突出［11］，同样也为“特洛伊木马”机制提供了依据。

隐球菌要想通过“特洛伊木马”机制进入中枢神经系统，首要条件是躲避吞噬细胞的杀伤作用并在细胞内存活繁殖。而通常巨噬细胞对外来病原微生物的杀伤作用依靠胞内的活性氧和活性氮来完成［12］；当机体缺乏脂多糖（LPS）和γ干扰素（IFN-γ）时，巨噬细胞停留在活化前状态，在吞噬隐球菌后并不发挥杀伤作用，而是作为“培养基”促使隐球菌在其内部复制增殖，以此逃避宿主细胞的免疫攻击。有研究人员对隐球菌脑膜炎患者的血浆／脑脊液样本进行鉴定和实验后发现，含有抗GM-CSF抗体的血浆能抑制GM-CSF诱导的信号传导及转录因子5（STAT5）的磷酸化，并阻止外周血单个核细胞产生巨噬细胞炎性蛋白-1，较免疫功能正常的隐球菌脑膜炎患者产生炎性因子减少，巨噬细胞吞噬隐球菌后不易被清除，从而更易进入中枢神经系统［13］，为巨噬细胞介导的感染机制提供了间接依据。隐球菌逃避巨噬细胞的杀伤力主要表现在多方面：首先，隐球菌与巨噬细胞接触后可通过一系列未明确的酶类代谢使NO解毒，阻止巨噬细胞产生NO；有研究发现，隐球菌蛋白激酶同源区基因PK H2-02在实验中能更好地保持病原体胞壁的稳定性，也更容易耐受活性氧和活性氮的杀伤作用［14］；其次，隐球菌野生株B3501在被巨噬细胞吞噬后，其隐球菌酚氧化酶结构基因CNLAC1、荚膜相关基因CAP60及NMT等主要毒性因子的基因表达明显下降，降低宿主免疫识别作用；再者，隐球菌在胞内可加强荚膜的表达，积累葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖，分泌多种蛋白参与细胞壁或荚膜多糖骨架，这些成分可以通过经典的内质网-高尔基体转运途径向菌体外释放膜性囊泡，这些囊泡可以被内化，激活巨噬细胞，提高促炎因子和NO的表达，以这种膜性囊泡的抗毒性机制为诱饵，使菌体远离功能性吞噬细胞［15］。另外，与脂质代谢有关的漆酶和磷脂酶1也有助于新型隐球菌在巨噬细胞内的存活，宿主细胞膜磷脂经磷脂酶B水解产生花生四烯酸，然后被释放到隐球菌的脂质池中，漆酶则将花生四烯酸生物合成为前列腺素E2，后者可激活巨噬细胞上的前列腺素类EP2受体，下调巨噬细胞的杀菌功能，促进隐球菌在巨噬细胞内的存活。在机体免疫力弱化时，隐球菌可以透过吞噬体膜，即肌动蛋白在吞噬体周围特异性短暂聚合以稳定吞噬体使其与质膜融合，通过肌动蛋白闪烁方式将新型隐球菌外排出巨噬细胞，或单纯依靠大量繁殖机械性破坏巨噬细胞结构而逃逸，入侵其他未活化巨噬细胞内复制，如此循环往复，造成菌体的大量增殖，提高入侵部位的菌体载量。此种作用可在Th1细胞因子的作用下加强，但是在细胞因子Th2的作用下，巨噬细胞的抗隐球菌功能会受到抑制，减少病原的外排率，这种机制使有可能被细胞杀伤的隐球菌逃逸到邻近的未感染的非杀伤细胞中，并长期留存下来，等待适宜机会离开细胞内环境，从潜伏期进入活动期［16］。

尽管有多个实验支持“特洛伊木马”机制在中枢神经系统感染中的重要作用，但有研究人员认为该机制或许并不是病原体跨越血-脑脊液屏障的主要机制。他们在隐球菌菌落中筛选出2种存在巨噬细胞黏附缺陷的菌株，分别为菌株12F1和菌株3C9，因为该种缺陷菌株不能有效地与巨噬细胞黏附，从而不容易被血流中的巨噬细胞所摄取，因此依靠宿主细胞进入中枢神经系统的可能性较小。实验结果与正常菌株相比，这2种缺陷菌株的被吞噬作用存在明显的差异，但进入中枢神经系统的能力并未受到影响，仍可有效地跨越血-脑脊液屏障。故研究者认为“特洛伊木马”机制在该实验中可能并不是跨越血-脑脊液屏障的主要机制，然而他们并没有排除“特洛伊木马”机制在其他情况下存在的可能性，如酵母细胞从明确的肺部感染引起中枢神经系统的侵袭时有可能该机制为其感染途径之一［8］。

三、细胞旁扩散转运机制

除以上2种机制外，研究者发现隐球菌还可通过脑微血管内皮细胞间的紧密连接跨越血-脑脊液屏障引起中枢神经系统感染，该过程可作为独立的病原入侵途径，也可以成为跨细胞膜转运的旁路发挥作用。在尿素酶促进隐球菌血运播散的研究中发现该机制［17］，研究人员分别用标准新型隐球菌菌株H99、尿素酶缺失菌株（ure1）及尿素酶修复菌株（ure1+ure1-1）静脉接种小鼠建立感染模型，随后发现尿素酶缺失菌株感染的小鼠死亡率明显下降，且该组小鼠死亡时中枢神经系统的隐球菌载量显著低于标准菌株感染的小鼠，随后的组织学分析发现，H99感染小鼠后，隐球菌通过血运播散至中枢神经系统，除黏附、跨越脑微血管内皮细胞外，还可造成内皮细胞间隙结构的破坏，形成间隙水肿；而ure1感染的小鼠因尿素酶缺失，分解内皮细胞紧密连接的作用大大减弱，故使得一部分菌体滞留在内皮细胞间隙，降低了感染中枢神经系统的毒力；而尿素酶修复菌株的感染作用则与标准菌株无统计学差异。这一发现提示了细胞旁转运机制存在的可能性。进一步的研究发现，隐球菌透过血-脑脊液屏障时，可与基底膜层粘连蛋白受体识别并结合，从而破坏层粘连蛋白的组分，而该蛋白作为基底膜的主要结构对基底膜的组装起关键作用，故该蛋白的破坏会引起连锁反应导致神经纤维网水肿，削弱内皮细胞间的牵拉作用，改变内皮细胞间的紧密连接，促进隐球菌通过紧密连接入侵中枢神经系统［18］。近年一项研究显示，将隐球菌与小鼠血浆共孵化后，血浆中富含的纤维蛋白溶酶原可结合并覆盖在菌体表面，通过信号转导活化成纤维蛋白溶解酶，二者作用于体外微血管内皮细胞时，可分解内皮细胞间的连接蛋白（包括糖性蛋白及蛋白多糖），使内皮细胞间隙疏松，从而增加隐球菌旁路途径入侵，增强其对血-脑脊液屏障的侵袭性［19］。

另外，研究人员应用甲基苯丙胺（一种具有成瘾作用的中枢神经系统兴奋剂）人为破坏微血管内皮细胞紧密连接，然后向小鼠静脉注射隐球菌，结果发现感染后小鼠平均存活期为3 d，而对照组为7 d，两者差异存在显著统计学意义。进一步病理及免疫组化分析发现，实验组小鼠除大脑损伤的区域及中枢神经系统隐球菌载量均有明显增加外，微血管内皮细胞间闭合蛋白的表达明显减少，其紧密连接结构也遭到严重破坏［20］，再次证实细胞旁扩散转运机制的存在。另有报道隐球菌通过增强尿酶的活性，可以直接影响脑微血管内皮细胞紧密连接的完整性，从而增加中枢神经系统的隐球菌载量［21］，成为支持该机制的又一依据。

综上所述，在中枢神经系统隐球菌感染的发病过程中，跨细胞膜转运机制为其最主要途径，通过对脑微血管内皮细胞的黏附、融合，以及改变内皮细胞骨架，从而透过血-脑脊液屏障。“特洛伊木马”机制和细胞旁扩散转运机制是其旁路途径，增强隐球菌透过血-脑脊液屏障的侵袭力。

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Molecular mechanisms of central nervous system cryptococcosis

CAO Yahui，WANG Xuan，ZHU Liping． （Department of Infectious Diseases，Huashan Hospital，Fudan University，Shanghai200040，China）

R519．4

A

1009-7708（2014）04-0357-04

2013-09-03

国家重点基础研究发展计划资助（2013CB531600）。

复旦大学附属华山医院感染科，上海 200040。

曹亚辉（1988—），女，在读硕士研究生，主要从事感染性疾病的临床与基础研究。

朱利平，E-mail：zhulp＠fudan．edu．cn。