白细胞介素22在玫瑰糠疹患者外周血单一核细胞及血清中的表达

孙怡 王振华

白细胞介素22在玫瑰糠疹患者外周血单一核细胞及血清中的表达

孙怡 王振华

目的探讨白细胞介素(IL)-22在玫瑰糠疹发病机制中的作用。方法荧光实时定量反转录(RT)-PCR检测玫瑰糠疹患者急性期、恢复期及健康对照组PBMC中IL-22mRNA的表达水平。采用酶联免疫吸附试验检测血清中IL-22的水平。结果玫瑰糠疹患者急性期、恢复期及健康对照组PBMC中IL-22 mRNA的相对表达量分别为4.15±1.36、2.89±0.91和1.91±0.60,急性期明显高于恢复期(t=3.61,P＜0.05),恢复期高于健康对照组(t=3.84,P＜0.05)。玫瑰糠疹患者急性期、恢复期及健康对照组血清中IL-22水平分别为(36.87±10.63)、(21.44±7.33)和(13.22±4.26)ng/L,急性期明显高于恢复期(t=5.01,P＜0.05),恢复期高于健康对照组(t=4.49,P＜0.05)。血清IL-22水平与玫瑰糠疹病程呈正相关(r=0.883,P＜0.05)。结论IL-22在玫瑰糠疹患者外周血及血清中表达明显升高,可能在玫瑰糠疹的发病中起一定作用。

糠疹,玫瑰;白细胞介素22;发病机制

玫瑰糠疹病因及发病机制不明,目前学者多认为该病与病毒感染和细胞免疫平衡失调有关。近期的研究发现,玫瑰糠疹患者表皮浸润的细胞主要为辅助/诱导T淋巴细胞,表皮、真皮乳头内朗格汉斯细胞明显增多,表明细胞免疫反应参与了本病的发生。白细胞介素(IL)-22属于IL-10细胞因子家族,主要由激活的Thl淋巴细胞、Th17细胞等产生,主要作用靶细胞为上皮细胞。我们检测IL-22在玫瑰糠疹急性期及恢复期患者外周血单一核细胞及血清中的表达,探讨IL-22在玫瑰糠疹发病中的作用。

一、对象与方法

(一)临床资料:收集2011年9月至2012年10月在潍坊市人民医院皮肤科门诊就诊、经临床确诊并符合以下条件的患者:①均有典型的临床表现,发病3～10 d;②受试前临床检查未发现急性感染征象,无其他免疫相关性疾病,发病后未接受系统用药及外用药物治疗。不合并有肝、肾及其他严重系统性疾病,非怀孕或哺乳期妇女,无非婚性接触史。共收集48例急性期玫瑰糠疹患者,其中男28例,女20例,年龄15～45(30.1±12.5)岁。恢复期为以上所有患者经窄谱中波紫外线(NB-UVB)治疗后皮疹消退,病程为14～52(32.85± 19.17)d。健康对照组为性别、年龄与病例组相匹配的同期健康体检者20例。

(二)治疗方法:给予患者NB-UVB治疗,初始照射剂量根据患者皮肤类型而定,一般为0.4～0.6 J/cm2,每次照射剂量较前次增加0.1 J/cm2,每周治疗3次。记录治疗次数,当皮损基本消退、疗效指数(即治疗前症状体征评分-治疗后症状体征评分/治疗前症状体征评分)＞90%时停止照射,治疗结束1周后采集静脉血。治疗次数为4～14(8.2±4.8)次。

(三)主要试剂和仪器:Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液、RPMI 1640培养液产自美国Invitrogen公司;RNAiso Plus、一步法反转录RT试剂盒、实时PCR试剂盒均产自日本TaKaRa公司;IL-22 ELISA检测试剂盒产自美国RD公司;荧光定量PCR仪(Icycler IQ Multicolor实时PCR检测系统)为美国Bio-Rad公司产品。

(四)实验方法:

1.血清和PBMC的分离:无菌条件下分别采集玫瑰糠疹患者急性期、恢复期和健康对照组外周乙二胺四乙酸抗凝血5 ml,室温1 500 r/min(离心半径15 cm)10 min,提取血清,分装入冻存管中。用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法获得PBMC,将PBMC装于1.5 ml微量离心管。标本均置于-70℃冻存备用。

2.PBMC中IL-22基因的检测:①提取RNA:按RNA提取试剂盒说明书提取PBMC总RNA,紫外分光光度计测定RNA含量;②RNA反转录:cDNA合成按照逆转录试剂盒说明书操作;③实时定量PCR:使用定量PCR反应仪,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,管家基因β肌动蛋白引物序列:上游为5′-CAAGCCTCCCAGTCCAAGAT-3′,下游为5′-ATTGCTGATGTCATAAGGGC-3′;IL-22 mRNA引物序列:上游为5′-CCAGGCTCAGCAACAGGCTAA-3′,下游为5′-TTTCAGCTCTGGTCAAATG-3′。采用25 μl反应体系,其中SYBR Green实时PCR Master Mix 12.5 μl,下游引物(10 μmol/L)各1 μl,模板溶液2.5 μl,反应条件为95℃60 s变性,然后95℃15 s,60℃15 s,72℃45 s,40个循环。收集荧光信号,得到每个标本不同指标的Ct值,以β肌动蛋白mRNA的量为内参照,根据公式2-△△Ct计算所测指标的相对表达量。

3.血清IL-22水平的测定:应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清IL-22水平,具体操作步骤按试剂盒说明书进行。用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度,并根据标准品的吸光度所对应的浓度绘制标准曲线,根据标准曲线计算样品浓度。

(五)统计学处理:采用SPSSl6.0统计软件。计量资料以±s表示,两组间比较采用t检验。采用Pearson进行相关性分析;检验水准α=0.05。

二、结果

1.PBMC中IL-22 mRNA的表达:急性期、恢复期玫瑰糠疹患者及健康对照组PBMC中IL-22 mRNA的相对表达量分别为4.15±1.36、2.89±0.91和1.91±0.60;急性期玫瑰糠疹患者外周血PBMC中IL-22 mRNA的表达明显高于恢复期(t=3.61,P＜0.05),恢复期高于健康对照组(t=3.84,P＜0.05)。

2.血清中IL-22的表达水平:急性期、恢复期玫瑰糠疹患者和健康对照组血清中IL-22水平分别为(36.87± 10.63)、(21.44±7.33)和(13.22±4.26)ng/L。急性期玫瑰糠疹患者血清中IL-22水平明显高于恢复期(t=5.01,P＜0.05),恢复期IL-22水平高于健康对照组,差异有统计学意义(t=4.49,P＜0.05)。

3.相关性分析:急性期玫瑰糠疹患者血清IL-22的水平(36.87±10.63)ng/L与玫瑰糠疹病程(32.85±19.17)d呈正相关(r=0.883,P＜0.05),与治疗次数呈正相关(r=0.751,P＜0.05)。

三、讨论

玫瑰糠疹发病原因仍未明确,但群集发病、很少复发、临床表现为发疹性皮疹及自限性病程等特点支持其发病与感染有关。已经有很多研究表明玫瑰糠疹发病与多种病毒感染[包括人类疱疹病毒(HHV)-6、HHV-7及甲型H1N1流感病毒等]有关[1-3]。还有研究[4]显示,T细胞在玫瑰糠疹的发生发展中起主要介导作用,与抗原提呈细胞密切相互作用,释放各种细胞因子,引起特异性免疫反应。

玫瑰糠疹和银屑病有很多相似之处,都是T细胞介导的炎症性皮肤病,且玫瑰糠疹也出现表皮角化不全、轻度棘层肥厚及真皮炎症。因此,与银屑病发病密切相关的IL-22同样也可能参与玫瑰糠疹的发病。Gangemi等[5]检测病情处于早期的16例玫瑰糠疹血清中IL-22水平,结果发现,患者血清中IL-22水平显著高于对照,但该研究病例数较少且仅对玫瑰糠疹早期患者的血清进行检测。本文研究结果显示,急性期玫瑰糠疹患者外周血PBMC中IL-22 mRNA表达水平明显高于恢复期及健康对照组,恢复期亦明显高于健康对照组。玫瑰糠疹急性期血清IL-22明显高于恢复期及健康对照者。提示玫瑰糠疹患者中IL-22高表达,而作为分泌IL-22主要来源的Th17细胞可能参与玫瑰糠疹的发病。

[1]Wolk K，Witte E，Wallace E，et al.IL-22 regulates the expression of genes responsible for antimicrobial defense，cellular differentiation，and mobility in keratinocytes:a potential role in psoriasis[J].Eur J Immunol，2006，36(5):1309-1323.

[2]Boniface K，Bernard FX，Garcia M，et al.IL-22 inhibits epidermal differentiation and induces proinflammatory gene expression and migration of human keratinocytes[J].J Immunol，2005，174(6): 3695-3702.

[3]Zheng Y，Danilenko DM，Valdez P，et al.Interleukin-22，a T(H) 17 cytokine，mediates IL-23-induced dermal inflammation and acanthosis[J].Nature，2007，445(7128):648-651.

[4]孙晓杰，刘文力，李铁男，等.玫瑰糠疹与人类疱疹病毒6型的关系[J].中华皮肤科杂志，2004，37(10):607.

[5]Gangemi S，Minciullo PL，Guarneri F，et al.Increased serum levels of interleukin-22 in patients affected by pityriasis rosea [J].J Eur Acad Dermatol Venereol，2009，23(7):858-859.

2013-10-31)

(本文编辑:尚淑贤)

Expressions of interleukin-22 in sera and peripheral blood mononuclear cells of patients with pityriasis rosea

Sun Yi，Wang Zhenhua.Department of Dermatology，Weifang People′s Hospital，Weifang 261041，Shandong，China

Wang Zhenhua，Email:wfzcwzh@126.com

ObjectiveTo investigate the role of interleukin-22(IL-22)in the pathogenesis of pityriasis rosea(PR).MethodsPeripheral venous blood samples were obtained from 48 patients with PR in acute stage and recovery stage and from 20 healthy human controls.Real-time fluorescence-based quantitative PCR was performed to measure the mRNA expression of IL-22 in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)，and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)to determine the level of IL-22 in sera.ResultsThe relative expression level of IL-22 mRNA in the patients with PR in recovery stage was significantly higher than that in the healthy controls(2.89± 0.91 vs.1.91±0.60，t=3.84，P＜0.05)，but lower than that in the patients in acute stage(2.89±0.91 vs.4.15± 1.36，t=3.61，P＜0.05).Similarly，the level of serum IL-22 was significantly increased in the patients with PR in recovery stage compared with the healthy controls((21.44±7.33)vs.(13.22±4.26)ng/L，t=4.49，P＜0.05)，and increased in the patients with PR in acute stage compared with those in recovery stage((36.87±10.63)vs. (21.44±7.33)ng/L，t=5.01，P＜0.05).The level of serum IL-22 was positively correlated with the stage of PR (r=0.883，P＜0.05).ConclusionsIL-22 is overexpressed in PBMCs and sera of patients with PR，implying that IL-22 is involved in the pathogenesis of PR.

Pityriasis rosea;Interleukin-22;Pathogenesis

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.022

261041山东,潍坊市人民医院皮肤科

王振华,Email:wfzcwzh@126.com