高效液相色谱法测定大鼠血浆中的丹参酮IIA浓度及其药代动力学研究※

●王晓萍 胡庆华

高效液相色谱法测定大鼠血浆中的丹参酮IIA浓度及其药代动力学研究※

●王晓萍1胡庆华2▲

目的：建立高效液相色谱法测定大鼠血浆中丹参酮IIA含量的方法，并用于药代动力学研究。方法：采用色谱柱为Phenomenex Luna C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5μm），流动相为1.6‰甲酸：甲醇（80：20 v／v），梯度洗脱，流速为1.0 mL·min-1，紫外检测波长343 nm。大鼠单剂量静注10mg ·kg-1的丹参酮IIA，HPLC-UV法测定丹参酮IIA的血药浓度，并采用DAS 2.0软件计算药代动力学参数。结果：方法学实验结果表明内源性杂质不干扰丹参酮IIA和内标的测定，线性范围0.039～10μg ·mL-1，定量下限为0.039μg·m L-1。方法精密度、准确度、稳定性和回收率均符合生物样品测定的要求，适合大鼠血浆中丹参酮IIA浓度的测定，可以应用该方法进行丹参酮IIA的药代动力学研究。大鼠单剂量静注10 mg·kg-1的丹参酮IIA后的AUC0→t、AUC0→∞、t1／2α分别为134.58±24.69μg·mL· min-1；135.36±24.76μg·mL·min-1；9.93±2.13min。结论：本方法操作简便、灵敏、专属性强，方法学考证符合生物样品测定的要求并成功用于丹参酮IIA在大鼠体内的药代动力学研究。

丹参酮IIA 高效液相色谱 药代动力学 大鼠血浆

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，其化学成分分为脂溶性和水溶性两部分。其中丹参酮IIA是脂溶性成分的代表，药理学研究报道丹参酮IIA具有广泛的生理活性，包括抗炎抑菌作用，清除自由基与抗氧化作用，保肝及改善肝功能，保护脊髓背角神经元作用，保护肾小管的正常结构和延缓肾间质纤维化、抗癌、改善血循环等［1-3］。其中对心脑血管作用的研究在医药领域尤其在中药领域受到国内外学者的高度重视［4］。丹参酮IIA因其作用广泛、毒性较低而具有较好的药用前景。本文建立高效液相色谱法测定大鼠血浆中丹参酮IIA浓度，并用于丹参酮IIA在大鼠体内的药代动力学研究。

1 试验材料

1.1 仪器 岛津（Shimadzu）高效液相色谱仪，包括LC-20AD送液泵、DGU-20A3在线脱气机、SIL-20A自动进样器、CTO-20A柱温箱、SPD-20A紫外检测器、CBM-20A系统控制器和Shimadzu Labsolutions色谱工作站；Milli-Q Gradient A10超纯水器（Millipore Inc.USA）；Thermo SPD-2010-230台式真空浓缩仪（Thermo Inc.USA）；Thermo Sorvall Stratos台式高速冷冻离心机（Thermo Inc.USA）；Vortex-2旋涡混合器（Scientific Industries Inc. USA）等。

1.2 试剂 丹参酮IIA（批号Y0001560，含量≥99%）和内标氯唑沙宗（批号C4397，含量≥99%）均购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，色谱级甲醇购自德国Merck公司；其余试剂均为市售分析纯。

1.3 实验动物 SD大鼠10只，体重180～250 g，雌雄各半，购自购于南京江宁青龙山实验动物中心，使用许可证号：SCXK（苏）2007-0008。

2 方法

2.1 标准溶液配制 丹参酮IIA标准品的配制：精密称取丹参酮IIA标准品5.00 mg，用甲醇10.0 mL溶解定容，配制成500μg·mL-1贮备液，临用时用超纯水稀释到相应的浓度。内标液氯唑沙宗的配制：精密称取氯唑沙宗10.00 mg，用甲醇溶解后，稀释至40μg·mL-1备用。

2.2 血浆中测定丹参酮IIA的HPLC-UV色谱条件色谱柱为Phenomenex Luna 5μm C18（150 mm×4.6 mm），流动相：水相（A）1.6‰甲酸，有机相（B）甲醇（80∶20 v／v）；流速1.0 mL·min-1；柱温40°C；紫外检测波长为343 nm；进样量20μL。

2.3 血浆样品处理 取血浆样品100μL，加内标10μL混均后，加300μL甲醇，振荡3 min，15000 rpm离心10 min，取上清200μL，15000 rpm离心10 min，取上清150μL进样。用样品与内标峰面积比进行定量分析。

3 结果

3.1 血浆中丹参酮IIA的测定方法学考察

3.1.1 方法特异性的考证 在本实验条件下，大鼠血浆样品峰和内标峰有较好的分离度，血浆中内源性物质与其他药物代谢物不干扰测定，基线噪音小，表明该方法专属性较好。丹参酮IIA的保留时间约为7.2min，内标保留时间约为8.2 min（图1），说明该方法专属性较高。在此条件下所测得的结果能代表丹参酮ⅡA浓度。

3.1.2 标准曲线的制备 取空白大鼠血浆90μL，加10μL不同浓度的标准品，使其浓度分别为0、0.039、0.078、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5和10μg· mL-1，按“血浆样品处理”项下操作，记录样品和内标峰面积，利用样品浓度C对样品与内标峰面积比R（As／Ai）作直线回归，得回归方程R＝1.2284C-0.0019，r2＝0.9995（n＝3），线性范围0.039～10μg ·mL-1，最低定量下限0.039μg·mL-1。

3.1.3 稳定性试验 分别考察了低（0.156μg· mL-1）、中（0.625μg·mL-1）、高（2.5μg·m L-1）3个浓度的含丹参酮IIA血浆样品室温放置6 h，反复冻融3次，-20°C冷冻放置2周，以及处理过的待测样本在进样器放置24 h的稳定性，结果表明样品在储存及测定过程中均稳定，RSD均＜10%。

3.1.4 精密度和准确度 用空白大鼠血浆配制低（0.156μg·m L-1）、中（0.625μg·m L-1）、高（2.5μg ·mL-1）3个浓度的样品各5份，连续测定3d，用随行标准曲线计算相应的药物浓度，分别考察日内和日间精密度与准确度。实验结果表明，低、中、高3个浓度的批内和批间RSD均小于10%，准确度为100.4%～107.2%。日内精密度最大为6.09%；日间精密度最大为4.15%，均小于10%。

3.1.5 提取回收率 取1.5mL Eppendorf管数支，加90μL甲醇，精密加入不同量的丹参酮ⅡA标准溶液，配成浓度分别为0.156、0.625、2.5μg·mL-1的丹参酮ⅡA溶液，平行制备5份，按“血浆样品处理”项下操作，加300μL甲醇振荡离心后，进样分析，记录色谱图，记录峰面积，进而计算求得峰面积均值另取1.5m L Eppendorf管数支，加90μL空白血浆，精密加入不同量的丹参酮ⅡA标准液，配成含丹参酮ⅡA 0.156、0.625、2.5μg·mL-1的血浆样品，平行制备5份。按“血浆样品处理”项下操作，加300μL甲醇振荡离心后，进样分析，记录色谱图，求得丹参酮IIA在低（0.156μg·mL-1）、中（0.625μg·mL-1）、高（2.5μg·mL-1）3个浓度的提取回收率分别为（91.2 ±3.59）%、（92.9±4.13）%和（91.8±4.89）%，回收率符合要求且稳定。

3.2 丹参酮IIA在大鼠体内的药代动力学研究 SD大鼠10只，雌雄各半，体重180～250g。禁食但可自由饮水12小时后，尾静脉iv 10mg·kg-1丹参酮ⅡA（每100g体重iv 1mL）。于给药前和给药后2、5、10、15、30、40、50、60、75min，眼眶静脉取血0.25mL于肝素化试管中，离心，分离血浆，置-20℃冰箱冻存至样品分析。测得丹参酮IIA的平均血药浓度-时间数据见图2。利用DAS2.0软件按统计矩法计算主要的药代动力学参数：AUC0→t、AUC0→∞、t1／2α分别为134.58±24.69μg·mL-1；135.36±24.76μg·mL-1；9.93±2.13min（见表1）。

4 讨论

本研究运用高效液相色谱法建立了大鼠血浆中丹参酮IIA血药浓度的检测方法，该方法简便、稳定、特异性强，为丹参酮IIA的动力学研究提供了方便、可靠的检测手段。在建立本定量分析法的过程中，对流动相的配比、比例以及色谱参数等分析条件进行了优化。对色谱柱进行选择时，我们比较了Phenomenex Luna C18色谱柱、Waters XBridge C18色谱柱和Shimadzu Inertsil ODS-SP色谱柱，结果表明在Phenomenex Luna C18色谱柱上可以获得分离完全、峰形对称的色谱峰。

有文献报道了丹参酮IIA在小鼠体内的药代动力学，实验结果表明小鼠静脉注射10mg·kg-1丹参酮IIA后其血药浓度-时间曲线符合二房室模型，在小鼠体内的分布迅速，消除速率较快，维持有效血药浓度的时间较短，在1.5 h至4.0 h内长期保持低浓度［5，6］。Li等建立了一个同时测定新西兰大白兔血浆中丹参素、阿魏酸、丹参酮IIA和隐丹参酮的HPLC方法，并用于丹芎方的药动学研究。研究表明，在耳缘静脉注射丹芎方后（以丹参酮IIA计，给药剂量为2.5mg·kg-1），丹参酮IIA的血药浓度-时间曲线符合二房室模型，其t1／2α和t1／2β分别为2.47min和135.1 min［7］。此外，有文献研究了丹参酮IIA在大鼠体内的药动学，结果发现大鼠灌胃15mg·kg-1丹参酮IIA后，吸收相半衰期为0. 15 h，消除相半衰期为3.16 h属于较短半衰期药物［8］。同时有研究显示丹参酮IIA在大鼠体内呈非线性药物代谢动力学，暗示其吸收和代谢在大鼠体内可能具有饱和性［9，10］。虽然已有文献报道了利用LC-MS／MS的方法测定大鼠血浆中丹参酮IIA的血药浓度并利用该方法进行了大鼠口服丹参酮IIA的药代动力学研究，但作者并未报道大鼠口服丹参酮IIA的药代动力学参数，但可知大鼠口服5mg·kg-1丹参酮IIA后，其血药浓度维持在较低水平，峰浓度不到50 ng［11］，提示丹参酮IIA的绝对生物利用度较低，口服吸收较差。到目前为止尚未有详细阐述静脉注射丹参酮IIA在大鼠体内药代动力学研究的报道。

本研究建立的丹参酮IIA检测方法及其在大鼠体内的药代动力学实验结果，将为今后全面评价丹参酮IIA的体内外药代动力学提供一定参考依据。

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医 论

阴阳对待流行说

人身之阴阳，有对待，有流行。对待者，一而二也，流行者，二而一也。非对待无以立阴阳之用，非流行无以见阴阳之用。故人之心肾二也，气血二也，水火二也。上下各有其位，左右各循其途，两者相为对待依附而不可离也。然水中有火，火中有水，气以行血，血以行气。心根于肾，肾根于心，二者又无始无端互为其宅而不可分也。夫心肾，阴阳之根抵也。言心肾，而水火气血皆在其中矣。今但以心肾言之，心为离火而实火之主，肾为坎水而实水之源，故坎中之阳必升，升则阴随阳发，十土由兹而癖，八木由兹而茂，而两丁之火乃光焰烛天矣。离中之阴必降，则阳随阴敛，五土由是而阖，九金由是而凝，而壬癸之水乃滔滔不竭矣。即如四时之运行亦然。春夏阳之升也，而浓云骤雨，草木敷荣，非阴随阳发之征乎！秋冬阴降敛也，而万宝坚凝，冰霜凛冽，非阳随阴敛之象乎？然此阴阳升降，流行不息，偏不倚无过不及者，有中道焉。过则必至于亢害，不及复至于凝滞。在天地为时令之失正，在人身则寒热之偏陂。古之圣人与日月合其明，四时合其序者，体其道也。

（摘自清·芬余氏《医源》）

国家自然科学基金资助项目（No.SFC 81202573）▲通讯作者 胡庆华，男，副教授，主要从事药学研究。E-mail：huqh＠cpu.edu.cn

1.江苏省盐城市妇幼保健院药事科（224002）；2.中国药科大学药学院（210009）