油茶总RNA的提取与内参基因的初选

宋志波，刘 敏，贾宝光，田 雷，曾艳玲，周俊琴，谭晓风，张 琳,2

(1.中南林业科技大学，a.经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室；b.经济林育种与栽培国家林业局重点实验室；c.经济林培育与利用湖南省2011协同创新中心，湖南 长沙 410004；2.康涅狄格大学 植物科学与园林建筑系，美国康涅狄格州 斯托尔斯 06269)

油茶Camellia oleifera，为山茶科山茶属常绿小乔木，因茶油(种子油)的高经济效用现已成为我国南方最主要的经济树种之一。开展油茶种子油脂代谢的分子生物学研究对于重要基因功能的揭示、通过分子育种手段对油茶进行定向品质改良具有重要意义。高质量的RNA是开展油茶分子生物学研究的基础，目前油茶种子RNA的提取方法已经趋于成熟[1]。笔者在油茶种子总RNA提取方法的基础上，对油茶各组织器官的RNA进行提取，并通过电泳检测及浓度测定检验RNA的质量，已获得了符合试验要求的RNA样本。

目前实时荧光定量PCR技术被广泛应用于基因表达特征的分析。高质量RNA是分子生物学研究的基础，稳定的内参基因是基因表达分析的必备条件。荧光定量试验，对RNA质量、PCR扩增效率等有严格的要求，内参基因的选择可以为实时荧光定量提供校准，因而选择合适的内参基因是提高试验准确性的重要前提之一。内参基因是指在生物生长发育过程中，在不同环境影响的情形下均可以稳定表达的基因。内参基因的选择是生物分子学分析准确性的保障，是分析其它基因表达特征的重要参照[2-6]。在油桐中，研究者通过对传统持家基因和新的内参基因表达的定量分析，发现ACT(Actin，肌动蛋白基因)、UBQ(Ubiquitin，泛素结合酶基因)、GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate ehy-drogenase，磷酸甘油醛脱氢酶基因)、EF1α(Elongation factor-1α，延伸因子基因)在油桐所有组织及不同发育时期种子中均可以较稳定表 达，ACT7、EF1β、GAPDH、TEF(Eukaryotic translation initiation，启动因子基因)则可以在油桐不同组织器官较稳定表达[7]；在亚麻中，研究者发现不同组织器官、不同生长发育时期均有不同的最适内参基因[8]。这说明，在实际试验中，内参基因只是在特定细胞条件下稳定表达，因此需要针对不同试验材料选取最适的内参基因。本研究中参考亚麻等植物内参基因的选择[7-9]，从前期构建的转录组数据中选取14个看家基因，设计相关引物，通过反应体系的优化，采用琼脂糖电泳分析等方法，快速筛选出油茶不同组织器官的最适内参基因。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料

于2012年6月初到10月底，采集油茶良种‘华硕’的根、茎、叶、花(花瓣、花柱、雄蕊)以及不同生长时期(6、7、8、9、10月)的果实样品，于-80℃超低温冰箱保存。

1.1.2 试验试剂

主要试剂包括: 全式金2×Easy Taq PCR Super Mix酶、TaKaRa荧光定量用反转录试剂盒、ambion RNA提取试剂盒、100 bp DNA lader、琼脂糖、CTAB、无菌水等，引物由华大基因公司合成。所有离心管、枪头及玻璃用具均用1‰DEPC水处理并灭菌。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA提取及质量检测

ambion试剂盒的CTAB法:

(1)研磨好的冻干样品约3g，加入预热好的混有 12μLβ-巯基乙醇的 600μLCTAB 裂解液中，漩涡混匀；

(2)65℃温浴10min，中间每隔2～3min振荡1次；

(3)加入氯仿/异戊醇(24︰1)600μL，漩涡混匀5min，冰上放置5min；

(4)12 000r/min，4℃离心5min，取上清液后重复1次；

(5)取上清液，加入ambion试剂盒中Lysis buffer 500μL，漩涡混匀，静置3min，12 000r/min，室温离心2min；

(6)取上清液，加入1/2体积无水乙醇，吸打混匀；

(7)按照试剂盒说明书中步骤继续进行。

从各组织器官提取的RNA中各取2μL进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，通过观察28s、18s条带亮度对RNA完整性进行分析；并通过紫外分光光度计对RNA样品的OD260/OD280比值及浓度进行重复检测，得到RNA浓度信息及质量检测结果。

1.2.2 内参基因的初选

1.2.2.1 引物设计

从转录组序列中挑出14个候选内参基因ACT(Actin，肌动蛋白基因)，ALB(albumin，血蛋白基因)，EF(Elongation factor，延长因子基因)，ETIF(Eukaryotic translation initiation，启动因子基因 )，GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate ehydrogenase，磷酸甘油醛脱氢酶基因)、TUB(tubulin，微管蛋白基因)、CYC(Cyclophilin，亲环蛋白基因)、UBC(Ubiquitin-conjugating enzyme，泛素结合酶基因)、UBQ(Ubiquitin，泛素基因)、DNAJ(DanJ-like protein，dnaj-类似蛋白基因)、SAND(Sand family protein，砂家族蛋白基因)、CAC(Clathrin adaptor complexes基因)、NAC(NAC domain protein基 因 )、LCR69(Low molecular weight cysteine-rich 69基因)的22个Unigene序列(见表1)，在NCBI网站进行BLASTN，发现它们与其它物种的同种基因的序列相似度均高于80％，可以确认其序列的正确性。

表1 候选内参基因引物设计Table 1 Primer design of the candidates of reference genes

1.2.2.2 内参基因初步筛选

使用TaKaRa荧光定量用反转录试剂盒对各样本总RNA进行反转录；然后选取种子cDNA为模板，使用不同引物进行扩增，通过琼脂糖电泳检测对得到的特异性强的引物进行筛选，再以油茶其它组织(器官)cDNA为模板进行扩增，对扩增结果进行检测分析。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取

提取不同组织的总RNA，进行电泳检测(见图1)，发现28s与18s条带清晰，点样孔明亮无蛋白质污染，虽然各样本RNA浓度不同，但28s与18s条带亮度比基本为2︰1，表明应用ambion试剂盒加上改良的CTAB法得到的RNA样本完整性较好。

图1 油茶各组织所提取RNA的电泳检测Fig.1 The agarose gel electrophoresis of total RNA samples extracted from different tissues in Camellia oleifera

同时使用紫外分光光度计检测各RNA样本的OD260/OD280值(见表2)，若其OD值低于1.8则表明RNA中糖类、蛋白质等污染较多，如果OD值高于1.8且在1.8～2.0之间则表明所提取RNA污染少。检测结果表明，所提取RNA的OD值在1.8～2.0之间，表明RNA质量较好，污染少，可以用于后续试验。

表2 各组织所提取RNA OD260/OD280值和RNA质量浓度†Table 2 The OD260/OD280 values and mass concentration of total RNA samples extracted from different tissues

2.2 候选内参基因扩增

2.2.1 随机模板扩增

随机挑选模板(见表3)对候选内参基因进行扩增，结果如图2所示。CYC1扩增条带大小为100 bp，与预期条带大小不一致，同样的非目标条带扩增还有CYC2、DNAJ、NAC1、SAND1、SAND2、aTUB2、TEF、UBC1、UBQ，表 明 这些基因的扩增不符合荧光定量引物设计原则中引物特异原则，进行排除；而在EF1α1、EF1β、LCR、NAC2、αTUB1引物扩增的电泳检测中出现2条带的扩增，按照荧光定量引物设计原则，如果扩增出现非特异性或者引物二聚体，不能作为内参基因使用，即表明EF1α1、EF1β、LCR、NAC1、αTUB1不适合作为荧光定量用内参基因。通过初次引物扩增，得到了扩增特异性强的基因ALB、ETIF3H、UBC(UBC2)引物。

表3 候选内参基因对应的随机模板Table 3 The random templates of the candidates of reference genes

图2 第1次无序扩增电泳检测Fig.2 The agarose gel electrophoresis of the fi rst PCR

2.2.2 以果实为模板的扩增

在初次扩增的基础上，对其中EF1α1、EF1β、CYC等传统持家基因进行了引物的第2次设计。模板统一使用‘华硕’果实的cDNA，通过在50～63℃间设置温度梯度扩增探索各引物最适反应温度。得到扩增特异性强且扩增片段大小正确的6个候选基因ALB、EF1α(EF1α1)、EF1β、ET1F3H、UBC(UBC2)(见图 3)。其中ALB扩增最适温度为56℃，EF1α为50℃，EF1β为53℃，ETIF3H为56℃，UBC为59℃。

2.2.3 以其它组织或器官为模板的扩增

使用第2次扩增得到的特异性强的基因引物，以油茶的根、茎、叶、花(花瓣、花柱、雄蕊)的cDNA为模板进行再次扩增，扩增产物电泳检测如图4所示。其中ALB与UBC在以油茶的根、茎、叶、花的cDNA为模板扩增出现引物二聚体，按照荧光定量引物设计原则，ALB与UBC不适合作为油茶根、茎、叶、花的内参基因；EF1α在以根、茎、花的cDNA为模板的扩增中均表现出特异性扩增，即EF1α可以作为油茶根、茎、花与果实的内参基因之一；EF1β在以叶、雄蕊的cDNA为模板的扩增中表现出特异性扩增，在以根的cDNA为模板的扩增中无条带出现，在以茎、花瓣以及花柱的cDNA为模板的扩增中出现非特异性扩增；ETIF3H在以根、茎、叶的cDNA为模板的扩增中出现特异性扩增，表明ETIF3H适合作为油茶根、茎、叶以及果实的内参基因之一，但ETIF3H在以花的cDNA为模板的扩增中无条带出现。

图3 以果实cDNA为模板PCR扩增电泳图Fig.3 The agarose gel electrophoresis of PCR taking cDNA extracted from fruit as templates

图4 以根、茎、叶、花瓣、花柱、雄蕊cDNA为模板PCR扩增电泳图Fig.4 The agarose gel electrophoresis of PCR taking cDNA extracted from roots,stems,leaves,petals,stilus and stamens as templates

3 结论与讨论

因为植物各组织器官组成成分差异较大，所以在各组织RNA的提取[10-13]中可能会遇到不同的问题。油茶果实中含有大量的不饱和脂肪酸、多糖等物质[14-17]，对RNA提取质量容易造成影响；在油茶的茎中有大量的纤维，同样也会影响RNA的提取质量。CTAB可以有效消除器官组织中的多糖和脂肪酸[18-21]，为提取高质量RNA提供一定的基础。在本研究中使用基于ambion的CTAB法[1]所得到的RNA质量高，证明CTAB在RNA提取中可以有效去除杂质影响，有利于油茶内参基因的筛选。

实时荧光定量是目前广泛应用于分析基因表达的手段之一。内参基因的选择直接影响结果的准确性。理想的内参基因在不同环境因子下不同组织器官中均可稳定表达。最近的研究表明，传统的持家基因在不同环境因子的影响下，或是在不同组织器官的不同生长时期均可能出现表达的不稳定。在茶树的内参基因筛选[22]研究中发现，并没有在所有组织中均稳定表达的基因；柑橘的内参基因筛选[23]研究同样证明不同组织的内参基因并不完全相同；而在油桐内参基因的筛选中，通过对传统持家基因和一些表达较稳定的基因对比，发现内参基因的选择并不是持家基因的表达最稳定，相对于不同器官组织有不同的最适内参基因。

为筛选油茶中的最适内参基因，为油茶基因的特征研究提供基础，本研究参考油桐、亚麻等植物内参基因的选择，挑选出14个基因，从转录组中得到其序列，设计特异引物，进行PCR扩增，通过电泳检测分析扩增结果。油茶果实的内参基因筛选试验结果表明，ALB、EF1α、EF1β、ETIF3H、UBC基因均有表达且扩增特异性强，可以选为油茶果实基因表达分析研究的内参基因。

为得到油茶各组织器官中均可以特异扩增的内参基因，将果实内参筛选结果应用于油茶的根、茎、叶与花，发现EF1α基因在油茶根、茎、花中均有表达并且扩增特异性强，而ETIF3H在油茶的根、茎、叶、花瓣中均出现特异性扩增。即EF1α可以作为油茶根、茎、花及果实的内参基因之一，ETIF3H可以作为油茶根、茎、叶的内参基因之一。试验结果表明，不同内参基因在不同组织器官中可能会出现不同的扩增结果，这可能是因为基因表达不同引起的非特异性扩增，因此，为得到不同器官组织不同生长时期的最适内参基因，应对内参基因的选择结果进行验证。

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