板栗实腐病菌rDNA-ITS 的RFLP和测序分析

傅本重，王立华，李国元，徐东生，王有宁，章爱群，邹礼平

(湖北工程学院 a.特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室；b.生命科学技术学院，湖北 孝感 432000)

板栗Castanea mollissima为壳斗科栗属植物，是原产于我国的重要干果类经济树种，已有数千年的栽培历史[1]。板栗是我国重点规划发展的经济林树种之一，全国种植面积达2.0×106hm2，年产量达1.5×106t以上，且逐年递增[2]。但是，因病虫害引起的板栗减产常达20％～80％，甚至造成绝收[1,3]，其中，由多种病原菌复合侵染的板栗实腐病(chestnut seed rot)是一种重要的板栗采后病害[4-5]，病害导致板栗的种仁变成土灰色、黄褐色至黑褐色，失去食用价值，是严重制约板栗产业发展的限制因素。

刘建华等从病栗的种仁中分离出了11个不同属的真菌和1种细菌，主要病原菌有Dothiorella gregaria、Colletotrichum gloeosparioides和Trichotheciu mroseum[6]。江苏新沂板栗实腐病的首要致病菌是炭疽菌C.gloeosporioides或小穴壳菌D.gregaria[7]。北京地区板栗实腐病的病原菌有5 种，强致病菌有C.gloeosporioides和D.gregaria，弱致病菌Fusarium solani,Phomopsissp.和Rhizopusstolonifer[4]。而王晓明等认为板栗坚果在贮藏期腐烂首先是由于生理伤害，其次才是病菌侵染[8]。这也可能是导致从板栗实腐病上分离出多种病原菌的原因之一。

ITS-RFLP是一种常用的病原菌多样性研究方法[9-10]。湖北板栗实腐病菌的种类报道较少。本文对分离自湖北省大悟县的11株板栗实腐病菌进行了初步研究，通过rDNA-ITS-RFLP进行了遗传多样性研究，并对病菌的ITS进行了测序和比对分析，研究结果可为进一步认识板栗实腐病菌的多样性和板栗贮藏期的病害管理提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

板栗实腐病感病栗于2012年10月采集于湖北省孝感市大悟县芳畈乡板栗林(N31°23′30.88″，E114°06′19.31″)，接种用的健康板栗购自本地市场。

1.2 病原菌的分离与保存

对板栗实腐病病栗除壳后按照常规组织分离法进行[11]。病原菌在PSA培养基(马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂15g，水1 000mL)上28℃条件下培养，进行5次以上边缘挑取菌丝接种新鲜培养基纯化。用菌丝块接种于健康板栗上，置于20℃保湿培养，完成科赫氏法则验证。菌株编号后接种PSA试管斜面，在4℃环境里保存。

1.3 病原菌的生长速率和致死温度测定

将活化的菌落打成直径7mm的菌饼，置于新鲜的PSA平板中央，在28℃下培养。每天测量菌落直径，直至菌落将要长满整个平板。测量菌落直径的变化量并计算其生长速率。

将生长旺盛的病原菌菌落打成直径为7mm的菌饼，置于5mL无菌水的试管，每管里放5个菌饼。分别设置40、45、50、55、60、65和70℃共7个温度梯度。在不同温度的水浴锅中水浴10min，取出菌饼接种于PSA上，28℃下培养。3d后观察是否有菌丝生长，通过不同的温度试验以确定致死温度。

1.4 病原菌的产酶能力试验

1.4.1 纤维素酶测定

纤维素酶活性用1％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物进行测定[12]。配制含1％CMC的固体培养基，接种病原菌，待长出菌落后用1mg/mL的刚果红溶液染色1h，用1mol/L的NaCl溶液浸泡30min。纤维素可与刚果红染料反应显刚果红色，不与纤维素水解产物纤维二糖和葡萄糖显色。根据其周围是否产生水解圈来判断酶活性。

1.4.2 过氧化氢酶试验

以铂丝接种针挑取少量菌丝涂抹于已加有10％过氧化氢的玻片上。观察是否产生气泡，如有气泡产生则为阳性，无气泡则为阴性[13]。

每个处理3个重复测试酶活性，试验重复1次。

1.5 病原菌rDNA-ITS 的PCR扩增及RFLP分析

病原菌基因组DNA的提取参照文献[14]进行。

用通用引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3’)和ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAA CAAGG-3’)PCR扩增ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列[15]。引物由上海Invitrogen公司合成。PCR扩增反应体系 25μL：12.5μL2×EasyTaqSuperMix(北京全式金)，ITS4(10 μmol/L)和ITS5(10 μmol/L)各 1.0μL，9.5μLddH2O，模板 DNA 为1μL。PCR循环：94℃预变性5min；94℃变性50s，50℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸 10min。

rDNA-ITS经PCR扩增后，分别用EcoRⅠ、HaeⅢ和TaqⅠ限制性内切酶(BBI)进行酶切。酶 切 体 系总体积 20μL：6μLPCR 产 物，2μLbuffer，1μL酶，11 μLddH2O。EcoRⅠ和HaeⅢ酶切在37℃下进行，TaqⅠ酶切在65℃下进行，酶切3h。产物经1.8％琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后紫外成像系统照相保存。

酶切图谱以DNA 某一片段在样品中出现赋值“1”，不出现赋值为“0”，构建初始数据矩阵。用NTSYSpc2.1专业版软件计算遗传相似系数，以平均连锁法(UPGMA)进行聚类分析，生成聚类图。

1.6 病原菌的ITS测序及分析

ITS的PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外光下切下大小约500～600 bp的条带，送上海生工双向测序。测序结果经NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在线BLAST比对分析，下载与比对序列一致性最高的序列作进化树分析。基于ITS序列进化发育树的构建用软件MEGA5.1进行，构建NJ树，自检值Bootstrap取1 000对系统树进行检验。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离

板栗实腐病病栗种仁呈现不同颜色，有灰白色、黄褐色和黑褐色等(见图1a)。对不同症状的病样进行病原菌的分离，得到11株真菌，并完成了科赫氏法则验证，编号分别为B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、S1、S4、X3 和 X6(见图 1)。

图1 板栗实腐病病栗及病原菌Fig.1 Chestnut seed rot samples and the colonies of pathogen

2.2 病原菌的生长速率和致死温度

对11株病原菌在28℃下，PSA培养基上的生长速率进行了测定。大多病菌生长速率达25mm•d-1以上，菌株X3的生长速率为11.7mm•d-1，与其他菌株的生长速率差异明显(P＜0.01)(见图2)。

图2 病原菌菌丝的生长速率Fig.2 Growth velocity of mycelia in pathogens

菌株的致死温度试验在湿热条件下进行。菌株 B2和 B4为50℃，B3、B4、B6、B7、B8、S1、S4、X3和X6在55℃处理下可以继续生长，60℃下致死。菌株B5能在65℃下继续生长，其致死温度高达70℃。

2.3 病原菌的纤维素酶和过氧化氢酶活性

纤维素酶测试，菌落周围都无水解圈，结果全部为阴性。

经过氧化氢酶测试，X6不产生气泡，结果为阴性；其余菌株全部产生气泡，产生气泡的量有一定差别，结果均为阳性。

2.4 病原菌的ITS-RFLP分析

PCR扩增病原菌的rDNA-ITS序列，得到一条大小为500～600 bp的清晰条带。与一般真菌的ITS 序列大小相近。分别用EcoRⅠ、HaeⅢ和TaqⅠ限制性内切酶进行酶切，酶切图谱统计得出11条清晰易辨的多态性DNA条带(见图3)。

应用NTSYSpc2.1专业版软件计算得到遗传相似系数矩阵。11个板栗实腐病菌株的遗传相似系数变异范围为0.385～1.000，遗传相似系数变化较大，遗传背景丰富。采用UPGMA法对11个供试菌株的遗传相似系数进行聚类分析，构建出11个板栗实腐病菌株的遗传亲缘关系图谱(见图4)。从聚类图可以看出，在相似系数为0.72水平下，11个供试菌株可分为4个类群。类群Ⅰ包括菌株B2、B3、B4、B5和 B8；类群Ⅲ包括菌株B6、B7、S1和S4；类群Ⅱ和Ⅳ仅有一个菌株，分别为X3和 X6。

图3 病菌的ITS-RFLP分析电泳图谱Fig.3 Electrophoresis result of ITS-RFLP of pathogens

2.5 病原菌的ITS测序及分析

对11个病原菌的ITS序列进行了双向测序，其大小在600 bp左右。将双向测序结果拼接，通过GenBank在线进行BLAST搜索。菌株 B2、B3、B4、B5、B7、B8、S1和 S4都能搜索到一致性在99％以上的菌株ITS序列多条，并且属于不同的种，主要有Diplodia seriata，Botryosphaeria obtusa和B.dothidea。B6与B.dothidea的ITS序列一致性为100％。X3的比对结果在99％一致性的有F.oxysporum、Gibberella moniliformis和F.proliferatum。菌株X6搜索的结果与Neofusicoccum parvum的各菌株一致性为100％。

将一致性最大的不同种菌株的ITS序列下载到MEGA5.1，构建进化发育树(见图5)。用Bootstap 1000对系统树进行了检验。进化树结构与RFLP结果相似。根据ITS序列以及形态观察，初步确定菌株B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、S1和 S4皆 为Botryosphaeria属( 无 性 阶段Diplodia)，菌株X3为Fusarium属(有性态Gibberella)，菌株X6为N.parvum属。

图4 基于ITS-RFLP的11个板栗实腐病菌株的聚类图Fig.4 Dendrogram of 11 strains of chestnut seed rot pathogens based on ITS-RFLP

图5 基于ITS序列的病原菌及相似菌株的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of pathogens and similar fungal species based on the ITS sequences

3 讨 论

本试验通过分离来自湖北大悟板栗产区的板栗实腐病菌，经纯化共得到了11个菌株。将这些菌株在人工接种条件下接种到果壳完好无伤口的板栗上基本不发病，而接种到果壳有伤口或者去壳、切开的板栗上则发病速度很快。这表明板栗实腐病菌菌丝的穿透能力不强，很难侵入到完好的板栗壳内。供试菌株的纤维素酶皆呈阴性，这可能是实腐病菌的寄生能力弱的原因之一，并与已有报道关于一般需要有伤口或是在生理病害发生之后才引起实腐的结论相一致[8]。

在28℃环境条件下，大部分菌株在PSA培养基上的生长速率达25mm•d-1，菌株X3的生长较慢，仅为11.7mm•d-1。真菌的rDNA-ITS序列分析是一种通用的分子鉴定手段，在大型真菌和杂交竹的病原菌鉴定中有应用[16-18]。经ITS测序及菌落形态观察，菌落背面产生有红色色素，因此确定X3为镰刀菌Fusariumsp.，但X3究竟属于何种则还有待进一步确定。

对分离自孝感板栗实腐病的11个菌株的ITS-RFLP进行了分析，通过聚类可以将它们分为4个类群，遗传相似系数最小为0.385。表明它们来源于不同的种。通过MEGA5.1将它们的ITS序列与NCBI中相似序列构建进化树，结合形态学特征确定这11个病原菌主要来源于3个 属：Botryosphaeria( 无 性 态Diplodia)、Neofusicoccum和Fusarium(有性态Gibberella)。

B.dothidea是葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae的模式种，分布广泛，种类繁多，寄主类型多样，是引起树木溃疡病最重要的病原，在我国常引起多种重要的经济树木枝条或主干发生溃疡病，包括杨树和多种果树等，如苹果的轮纹病[19]，也是金荞麦和苦荞麦的内生菌[20]。该菌是否为板栗的内生菌而且是否会在条件适宜的情况下致病，还有待进一步确认。其中一个菌株B5的致死温度高达70℃，这是否与板栗实腐病不易清除有关，也有待进一步研究分析确认。

国内报道的板栗实腐病病原菌有10多个属，据现有文献[4,21-23]，初步确定小新壳梭孢Neofusicoccum是一个新的引起板栗实腐病的属。澳大利亚曾有报道N.parvum引起南洋杉溃疡和衰退病[24]，美国报道该菌引起了弗罗里达州桃金娘Syzygium paniculatum的死亡[25]。西班牙成熟的鳄梨树出现枝枯及死亡症状，经证实病原菌为N.parvum，而该菌曾作为B.parva(葡萄座腔菌属)的无性阶段而被报道。台湾地区报道

Neofusicoccum属真菌引起梨果腐病[26]，该属病原菌侵染板栗引起病害的机理还需要进一步确定。板栗实腐病是在栗树生长季节侵染、板栗果实贮运期发病的一种潜伏侵染病害。在较适宜的贮藏条件下，板栗实腐病的损失约为10％左右；而贮藏不当时，损失率可高达50％[3]。板栗实腐病菌的种类多样，发病机理复杂。近年来关于病害发生率的调查报道较少，但据多处实地了解，板栗实腐病的发病率仍然较高。国家林业局确定了我国26个“板栗之乡”，并于2012年成立了中国经济林协会板栗专业委员会，板栗是山区人民脱贫致富的重点林业产业，因此控制板栗实腐病有重要的经济和现实意义。对于板栗实腐病的基础研究及病害控制亟待进一步加强，这样才有利于我国板栗产业的健康、快速和可持续发展。

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