利用RAMP分子标记对酸枣资源的遗传多样性分析

2014-01-22张建英毛向红张莹莹

经济林研究 2014年2期

张建英，毛向红，张莹莹

(1.河北省林木良种工程技术研究中心，河北石家庄 050061；2.河北省林业科学研究院，河北石家庄 050061)

酸枣Ziziphus acidojujubaC.Y原产我国，在我国分布极为广泛，是枣的原生种，距今已有1 200万年以上的历史[1]。酸枣具有较高的营养和药用价值，其保健功能早已得到了人们的认可，以酸枣为原料的加工产品受到了现代人的青睐。目前有关酸枣的研究主要集中在果肉、种仁、酸枣叶等器官的营养价值和药理作用以及加工等方面。

遗传多样性具有广泛性、特异性和适应性等特点，遗传变异广泛存在于自然界各种生物体内，是生物进化的根本动力[2]。酸枣在长期的进化过程中，经过自然选择和人为因素的综合作用，产生了大量的变异，种质资源极为丰富。关于酸枣分子水平上的研究报道较为鲜见，为了更好地开发利用酸枣资源，获得更高的效益，有必要对其进行相关的遗传学研究[3]。近年来，随着对枣种质资源遗传多样性研究的起步，分子标记技术在枣种质资源鉴定方面的应用逐渐增多，刘孟军[4]首次采用RAPD分析方法，将亲缘关系极近的金丝小枣和无核小枣区分开来。赵锦[5]通过RAPD分析从DNA水平上揭示了枣属中枣、酸枣和毛叶枣3个种之间的亲缘关系，同时建立了供试材料的RAPD指纹。但RAPD技术对外界条件的微小变化反应太过敏感，受反应条件的影响较大，相对来说，RAMP技术能更准确地揭示物种间的遗传关系[6]。本试验中尝试用RAMP技术对31份采自不同区域的酸枣种质资源进行遗传多样性分析，旨在阐明该树种不同区域生长群体间存在的遗传差异，保护该树种基因资源多样性，同时为酸枣新品种培育工作的种源选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验中所用酸枣样品于2011年7月采自河北省的石家庄、怀来、赤城、遵化、隆化、涉县，山西省的汾阳以及辽宁省。样品共计31份(见表1)，包括27份酸枣资源、4个大枣品种。1～21号样品采自从原产地引进接穗嫁接到河北省林业科学研究院资源圃的植株。

表1 供试酸枣样品Table 1 The tested samples in Z.acidojujuba

采集健康植株的幼嫩叶片，采后立即用锡箔纸包裹并置于液氮瓶中冷冻，带回后存放于-70℃的超低温冰箱中待测。

试验中所用引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司；TaqDNA聚合酶和dNTP购自大连宝生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取

酸枣基因组DNA的提取采用改良CTAB法[7]。

(1)将高盐CTAB缓冲液在65℃离心管中预热处理。

(2)称取150mg新鲜、干净酸枣叶片置于1.5mL离心管中，先加入500μLDNA预处理液快速研成粉末，再加入500μL预处理液，然后与预热的高盐CTAB 缓冲液充分混匀，65℃水浴条件下60min，其间上下颠倒混匀几次。

(3)取出离心管，室温下冷却4～5min，吸取上清液，加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液(25︰24︰1)混匀，室温下静置5min，于室温下12 000g离心8min。

(4)取上清液，加入等体积的氯仿、异戊醇混合液(24︰1)，充分混匀后室温静置5min，室温下12 000g离心8min；取上清液，重复加等体积氯仿、异戊醇混合液(24︰1)抽提。

(5)取上清液，加入等体积氯仿抽提1次。

(6)取上清液，加入2倍体积的-20℃的无水乙醇，轻轻混匀，-20℃沉淀30min以上，12 000g离心10min。

(7)将所得沉淀风干至透明状，然后溶于100μL水中，放于4℃冰箱中备用。

1.2.2 PCR扩增反应与电泳[5]

优化酸枣DNA基因组RAMP-PCR 10μL反应的最优条件为：Mg2+浓度3.0mmol/L，引物浓度1.0 μmol/L，dNTPs浓度 0.15mmol/L，TaqDNA 酶为1.5 U。

扩增反应程序如下：95℃，4min；95℃，50s；50℃，50s；72℃，1.5min，共30个循环。完成最后1个循环后72℃下延伸10min。

反应产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，0.1％ AgNO3染色10min，显色液(1.5％NaOH，0.4％甲醛)显色，然后用10％乙醇0.5％乙酸固定，最后观察并拍照记录。

2 结果与分析

2.1 31份样品的RAMP分析

RAMP扩增选用5′锚定的引物即 GC(CA)4和GT(CA)4与上海生工生物工程公司生产的十聚体随机引物组成对材料进行扩增筛选，从中共筛选出具有明显扩增产物的14条引物组合用于试验。扩增结果见表2。由表2可以看出，RAMP1+S427、RAMP+S485、RAMP+S26引物组合多态性较高，达到90％以上；RAMP1+S372引物组合最低，为33.3％；其余引物介于中间。14条引物共扩增出112条DNA片段，其中87条具有多态性，多态性比率为77.7％，每个引物扩增出1～10条多态性带，平均每条引物扩增6.2条，说明采集的样品在分子水平上存在较大的差异。

图1为以RAMP1+RAMP2F组合为引物的部分酸枣PCR样品电泳图谱，以RAMP为引物得到的扩增产物片断大小主要分布在300～700 bp之间。

表2 14条引物对酸枣样品的扩增结果Table 2 Amplification result of the samples in Z.acidojujuba by using 14 primers

图1 以RAMP1+RAMP2F为引物的部分酸枣PCR样品电泳结果Fig.1 Electrophoresis result of partial PCR samples in Z.acidojujuba by using RAMP1+RAMP2F as the primer

2.2 31份样品的的遗传关系分析

对31份样品经RAMP-PCR扩增的300～700 bp范围内条带分别赋值，同一位置有带的记为1，无带的记为0。按照Nei和Li方法计算遗传相似系数[8]。根据14条引物对样品基因组DNA的随机扩增结果，通过计算，建立树状聚类图(见图2)。由图2可知，31份样品间的遗传距离范围为0.120 9～0.517 2。其中，3号井22A和6号井22C间遗传距离最小，为0.120 9；5号井21和其它样品间遗传距离均较大，与27号新立河南1的遗传距离最大，为0.517 2。

根据扩增结果将参试的31份样品在遗传距离0.34处做结合线，可将其分为6大类。

第1大类包括18份样品，可以将其分为3组：第1组包括1号、8号、13号、 3号、6号、10号、4号、7号、9号、24号10个酸枣样品和20号、21号2个大枣品种；第2组包含2号、16号、15号3个酸枣样品和1个大枣样品(18号唐星)；第3组为12号和14号样品。这一类中除了第1组中的20号、21号2个大枣品种和24号酸枣样品外，其它15份样品均原产于河北省中南部的石家庄和保定。

第2大类包括11份样品，可以分为2组：第1组为22号、23号、27号、29号、30号、28号6个样品，采自河北省东北部的怀来、遵化以及与河北东北部交界的辽宁省；第2组为25号、26号和31号3份样品，采自河北省的隆化、涉县和山西汾阳。

第3～6大类各只包括1份样品，分别为11号‘武GY08’、19号‘曙光’、5号‘井21’、17号‘易GY13’，均来源于河北中南部。

图2 31份酸枣样品聚类分析Fig.2 Cluster analysis on 31 samples in Z.acidojujuba

3 结论与讨论

样品多态性分析结果表明，在24条引物中筛选出14条对31份样品进行扩增，共扩增出112个片段，其中87条具有多态性，占总扩增带数的77.7％，显示出供试样品具有丰富的遗传多样性。表明利用RAMP分子标记技术能够把供试材料区分开并表明它们之间亲缘关系的远近，此项技术的应用能够为酸枣品种鉴定、保护及应用研究提供理论依据。

样品的聚类分析结果表明，最少通过4对引物(RAMP1+S427、RAMP1+S485、RAMP1+RAMP2F、RAMP1+S26)可以对 31个酸枣品种进行聚类；31份样品间的遗传距离为0.120 9～0.517 2，3号井22A和6号井22C间遗传距离最小，而且二者产地相同，由此推断在起源上有共同的遗传来源；5号井21与其它样品间遗传距离较大，与27号新立河南1的遗传距离最大，表明二者亲缘关系最远。根据扩增结果可将参试的31份资源划分为6类，酸枣资源没有首先聚成一类，和4个大枣品种之间也无明显的分类界限，有的酸枣之间的亲缘关系远于大枣，冬枣、新星、唐星、曙光4个大枣品种也未聚成一类。枣与酸枣均属于鼠李科枣属植物，但二者的分类存在较大争议[9]。根据试验结果进行推测，酸枣向大枣演变的过程是极为复杂的，不同区域酸枣的进化阶段并不相同，酸枣向大枣的进化是通过多条路径在不同的地理区域完成的。

在每一类组里除了个别样品外大都表现为地理位置接近的资源聚为一组，表现出了地源优先的原则，但也有个别样品例外。酸枣的发展演变经历了上千万年的历史，一些个体从一个群体到另一个群体的迁移会把某种基因带到新的群体，从而产生基因的流动。花粉和种子的扩散与传播更是自然界普遍存在的现象，这2种传播方式是基因流动的主要形式[10]。因此，个别样品的聚类可能受到试验过程中的误差或者资源本身曾经经历的基因流动[11-13]的影响。

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