食管鳞癌组织中GRIM-19的表达及意义

陈 铎，张牧霞

(河北医科大学第三医院实验中心，河北 石家庄050051)

食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，我国是食管癌的高发国家之一，且我国食管癌组织学类型90%以上为鳞癌［1］。食管癌被公认为一种基因性疾病，有多种癌基因和抑癌基因参与了食管癌细胞的增殖及凋亡等。干扰素/维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因- 19 (gene associated with retinoid-interferon-induced mortality-19，GRIM-19)是GRIMs 家族重要成员，其在多种正常组织中表达，参与干扰素和维甲酸诱导的细胞凋亡［2］。研究［3］表明，GRIM-19 在多种肿瘤组织中表达抑制、表达异常或突变。有关GRIM-19 蛋白在食管鳞癌组织中表达的研究尚未见文献报道。本研究采用免疫组化技术检测食管鳞癌、癌旁不典型增生及正常食管黏膜组织中GRIM-19 蛋白表达，运用TUNEL方法检测食管鳞癌组织中的细胞凋亡，探讨GRIM-19蛋白的异常表达与食管鳞癌发生及细胞凋亡的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 组织标本来源 68 例食管鳞癌、35 例癌旁不典型增生及68 例正常食管黏膜组织来自安阳市肿瘤医院2008年3月至2010年3月手术切除标本。其中男44 例，女24 例，年龄35 ～75 岁，中位年龄54 岁。浸润黏膜下层或浅肌层者9 例，浸润深肌层或外膜层者59 例;伴淋巴结转移者20 例，无淋巴结转移者48例;术前均未接受放、化疗。所有标本均经病理证实为食管鳞癌(经HE 染色证实，癌旁组织中35 例存在不典型增生)，正常食管黏膜组织取自远端手术切缘并经病理证实。

1.1.2 主要试剂 鼠抗人多克隆GRIM-19 蛋白抗体购自美国Abcam 公司;ZYMED S-P 免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;TUNEL 试剂盒购自德国Roche 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组化主要步骤 免疫组化采用S-P 法，操作步骤按照试剂盒说明书进行。用已知阳性的乳腺癌组织切片作为阳性对照，以PBS 液代替一抗作为阴性对照。

1.2.2 免疫组化结果判定 GRIM-19 蛋白阳性表达信号主要定位在细胞核或细胞质中，呈棕黄色颗粒。参照Formowitz 等［4］的综合计分法进行结果评定，以确定蛋白阳性表达。具体方法:高倍镜视野下计数500个细胞，计算阳性细胞数占总细胞数的百分比评分。阳性细胞所占比例＜5%记为0 分，5% ～25%为1 分，26% ～50%为2 分，51% ～75%为3 分，＞75%为4分。染色强度评分，样本无染色为0 分;呈现淡黄色颗粒，明显高于背景为1 分;出现浅棕黄色颗粒为2 分;出现大量深棕黄色颗粒为3 分。将样本两者得分相加为总分。根据分数把样本界定为4 类:0 ～1 分为阴性(-)，2 ～3 分为弱阳性(+ )，4 ～5 分为中阳性(++)，6 ～7 分为强阳性(+++)。

1.2.3 TUNEL 方法主要步骤 将组织标本进行脱蜡和水化;蛋白酶K(pH 7.4 ～7.8)室温孵育20 min;滴加TUNEL 反应混合液后37 ℃下在暗湿盒中反应1 h;荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450 ～500 nm，检测波长为515 ～565 nm);滴加50 ～100 μL DAB工作液，室温下反应10 min，至出现棕色背景为止;苏木精复染3 min;光学显微镜观察凋亡细胞(共计200～500 个细胞)并拍照。

1.2.4 TUNEL 方法对照组设计 阳性对照:以已知TUNEL 阳性切片做阳性对照。阴性对照:制备TUNEL反应混合液时，不加酶浓缩液。

1.2.5 TUNEL 检测结果判定 显微镜下观察到的凋亡细胞核固缩呈圆形或椭圆形，染色呈现棕褐色，阴性细胞核无着色。在镜下计数200 个细胞，观察呈现凋亡阳性的细胞数，每组选取5 个分布均匀的视野，取平均值，计算细胞凋亡指数(apoptosis index，AI)=(凋亡细胞数/200)×100%。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0 进行统计分析，采用χ2检验来进行样本率的比较，相关关系分析用Spearman 相关性分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 不同组织中GRIM-19 蛋白的表达 GRIM-19 蛋白阳性表达信号主要定位于细胞核或细胞质中，呈棕黄色颗粒，阳性对照有阳性信号显示，阴性对照无阳性信号显示。GRIM-19 蛋白在正常食管黏膜组织、癌旁不典型增生组织及食管鳞癌组织中的阳性表达率分别为80.9%(55/68)、34.3%(12/35)和11.8%(8/68)，两两比较差异均有统计学意义(P 均＜0.05)。

2.2 GRIM-19 蛋白表达与肿瘤细胞凋亡的关系 食管鳞癌凋亡细胞核固缩呈圆形或椭圆形，染色呈现棕褐色，阴性细胞核无着色。食管鳞癌组织中肿瘤细胞的凋亡与GRIM-19 蛋白表达有关，GRIM-19 蛋白阳性表达组中肿瘤细胞AI 为(5.06 ±0.93)%，显著高于阴性表达组的(1.12 ±0.06)%，差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

GRIM-19 是Kalvakolanu 采用反义RNA 敲除技术在乳腺癌细胞中筛选鉴定并首先报道的凋亡蛋白［5］，GRIM-19 是GRIMs 家族重要成员，编码含144 个氨基酸残基的蛋白质，相对分子质量约16 000，定位于19p13.1。GRIM-19 是一种保守基因，在多种正常组织中表达，参与干扰素和维甲酸诱导的细胞凋亡［2］。GRIM-19 蛋白的异常表达激活细胞的凋亡过程，但仅仅GRIM-19 蛋白的异常表达并不足以引起细胞凋亡，GRIM-19 蛋白的异常表达可以增加细胞对干扰素和维甲酸诱导的凋亡的敏感性，同时，GRIM-19 蛋白是一种小的核蛋白，可能协助转运凋亡激活蛋白进入细胞核，GRIM-19 蛋白的羧基端对其诱导细胞凋亡是必不可少的，其表达降低或位点突变可以导致细胞的异常增殖和恶性转化［6］。研究［3］表明GRIM-19 在多种肿瘤组织中表达抑制、表达异常或突变。

GRIM-19 在正常细胞中的表达可以维持细胞正常的生活周期，促使衰老细胞凋亡，其基因突变、缺失或表达下调均可引起细胞发生异常增殖。目前GRIM-19对细胞增殖和凋亡的影响日益受到重视，但文献［7-12］报道多集中在GRIM-19 异常表达与肿瘤发生发展的关系方面。有关GRIM-19 异常表达与肿瘤细胞凋亡关系的研究相对较少，GRIM-19 异常表达与食管癌细胞凋亡关系的研究尚未见文献报道。本研究运用免疫组化技术检测68 例食管鳞癌、35 例癌旁不典型增生及68 例正常食管黏膜组织中GRIM-19 蛋白表达，并采用TUNEL 方法检测食管鳞癌组织中的细胞凋亡。结果显示，GRIM-19 蛋白在正常食管黏膜组织、癌旁不典型增生组织及食管鳞癌组织中的阳性表达率依次降低;GRIM-19 蛋白阳性表达组中肿瘤细胞AI 显著高于阴性表达组。结果提示，GRIM-19 蛋白的低表达可能与食管鳞癌的发生发展有关，且与食管鳞癌细胞的凋亡相关。该研究结果为进一步探讨食管鳞癌等恶性肿瘤的凋亡机制奠定了一定的理论基础。

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