亚精胺对小鼠骨骼肌自由基代谢影响及抗疲劳的效果研究

何恩鹏，汤莉莉，郭玉江

亚精胺对小鼠骨骼肌自由基代谢影响及抗疲劳的效果研究

何恩鹏，汤莉莉，郭玉江

（新疆师范大学运动人体科学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830054）

目的：研究亚精胺（spermidine，SPD）对骨骼肌自由基 代谢的影响以及抗疲劳作用。方法：实验分为生理盐水组、SPD低剂量组（0.5 mmol/（kg·d））、中剂量组（1.0 mmol/（kg·d））、高剂量组（1.5 mmol/（kg·d））以及西洋参口服液阳性对照组（总皂苷30 mg/（kg·d）），每周灌胃6 d共30 d，每次灌胃前称量小鼠体质量调整灌胃溶液量，灌胃期间进行每天45 min无负重游泳训练。各组随机选取10只小鼠测试力竭游泳时间；各组剩余10只负重游泳30 min，休息30 min后取材，检测血清肌酸激酶（creatine kinase，CK）、骨骼肌谷胱甘肽-过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、总超氧化物歧化酶（total-superoxide dismutase，T-SOD）、琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）活性和骨骼肌丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。结果：与生理盐水组比较，SPD能显著延长小鼠力竭游泳时间（P＜0.05）；低、中剂量组骨骼肌中GSH-Px、T-SOD、SDH酶活性显著提高（P＜0.05），MDA含量显著降低（P＜0.05）；SPD组与西洋参组比较，低、中剂量抗疲劳效果有非常显著性（P＜0.05）差异，高剂量抗疲劳效果略优（P＞0.05）。结论：0.5～1.0 mmol/（kg·d） SPD可以增加抗氧化酶的活性，减少自由基的积累，提高骨骼肌细胞膜代谢能力和抗损伤能力，显著推迟小鼠疲劳发生。

亚精胺；疲劳；谷胱甘肽-过氧化物酶；丙二醛；琥珀酸脱氢酶

疲劳是一种复杂的生理现象，疲劳的积累可造成机体内分泌紊乱、免疫力低下，严重威胁人类健康，因此如何推迟疲劳发生逐渐成为研究热点。研究证实，体内氧自由基及其引起的脂质过氧化反应可以攻击细胞及线粒体等生物膜，造成线粒体钙循环失调，之后通过影响基质内的酶系统而使细胞能量转换功能降低是导致疲劳发生的重要途径之一[1]。

亚精胺（spermidine，SPD）是一类含氨基的三价阳离子脂肪胺化合物，能够跨越临界距离以静电作用方式与细胞内的多聚阴离子，如核酸、蛋白质和 ATP 等，实现可逆的相互作用[2-3]，所有原核和真核物种中都含有亚精胺[4]，亚精胺主要分布于哺乳动物细胞的细胞质中，细胞核中也含有少量亚精胺。亚精胺是细胞生长、分化和死亡的关键性调节者，同时还是DNA、RNA和生物膜的稳定因子，还可作为抗氧化剂、 营养素以及第二信使[5-7]。Eisen berg等[8]研究发现，在人类衰老细胞中亚精胺浓度出现下降的现象，同时，亚精胺可以强烈的抵抗衰老小鼠的氧化应激，人为减少细胞内源性亚精胺含量会造成细胞氧化应激加强，自由基累积，从而加速细胞死亡。

亚精胺可以通过减少细胞内自由基的积累进而减少氧化应激对机体的损害，那么亚精胺是否可以通过此作用机制推迟疲劳的发生？查阅文献未见亚精胺在疲劳发生中作用的相关报道，为了研究其在疲劳发生中的作用，本实验从亚精胺对长期从事体育锻炼小鼠骨骼自由基清除酶和自由基产生影响着手研究，探讨亚精胺在疲劳消除中的关键作用，并对其抗疲劳效果进行系统评价，为亚精胺成为抗疲劳补剂开发及应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

健康昆明系小鼠，清洁级，体质量（20±2）g，雄性，购自新疆医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（新）2011-0004。常规分笼喂养，国家标准啮齿类动物饲料喂养，自由进食和饮水（纯净水），室内相对湿度40%～55%，温度21～4℃，光照时间l2 h。

小鼠被随机分成生理盐水组、亚精胺低剂量组（0.5mmol/（kg·d））、中剂量组（1mmol/（kg·d））、高剂量组（1.5 mmol/（kg·d））以及西洋参口服液阳性对照组（总皂苷30 mg/（kg·d））5组，每组20只，共计100只，被试浓度的确定根据Eisenberg等[8]的研究确定。

1.2 试剂与仪器

亚精胺 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；肌酸激酶（creatine kinase，CK）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、总超氧化物歧化酶（totalsuperoxide dismutase，T-SOD）、谷胱甘肽-过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

Biospectrometer basic分光光度计 德国Eppendorf公司。

1.3 受试液配制方法和浓度

取14.525 g亚精胺（Mr=145.25）加入生理盐水定容至1 000 mL，配成100 mmol/L高浓度被试液，后继续用生理盐水稀释成60 mmol/L和30 mmol/L被试液，以保证每组灌胃药物体积相等。

1.4 运动方案及药物服用方法

小鼠适应性饲养2 d，适应性游泳训练3 d，之后所有动物均采用无负重方式每天游泳锻炼45 min，每周锻炼6 d休息1 d，共计游泳锻炼30 d，锻炼期间每天灌胃1次，每次灌胃前称量小鼠体质量调整灌胃溶液量，生理盐水组灌胃等体积生理盐水，中午灌胃下午锻炼。

1.5 小鼠力竭游泳时间测试

于末次给药30 min后，每组随机选取小鼠10只，尾根部负其体质量5%的铅皮，放入水温为30℃水深35 cm的泳箱中[9]。参照Mcardle推荐的力竭判断标准，即小鼠头部沉入水中，经10 s仍不能返回水面视为力竭。记录游泳开始至力竭的时间作为小鼠力竭游泳时间。

1.6 样品的制备

1.6.1 血清的制备

末次给药30 min后，每组选10只小鼠，在其尾根部负小鼠体质量5%的铅皮，放入30℃、水深35 cm的泳箱中，40 min后取出，休息30 min后摘眼球取血，于1.5 mL离心管中常温放置2 h，再放入4℃冰箱过夜，吸取血清－20℃保存。

1.6.2 肌肉组织匀浆的制备

准确称量小鼠骨骼肌2 g，加入9倍体积的匀浆液，冰浴下匀浆机匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清分装－20℃保存。具体测定方法按照试剂盒说明书进行。

1.7 统计学处理

实验数据以x±s示，组间均数差异采用单因素方差分析中的最小显著差数法（least significant difference，LSD）进行统计学比较，P＜0.05表示差异有显著性。

2 结果与分析

2.1 亚精胺对小鼠体质量和游泳时间的影响

由表1可知，各组动物实验初期体质量均无显著差异（P＞0.05），末期亚精胺组小鼠体质量增长较快，但与生理盐水组相比均未见显著差异（P＞0.05）。与生理盐水组相比，亚精胺低、中、高剂量组力竭运动时间均显著提高（P＜0.05）；与西洋参组比较，低、中剂量组亦表现出较强的抗疲劳效果（P＜0.05）；同时，随着亚精胺浓度的升高，运动时间出现降低的现象，但低剂量组与中剂量组差异不显著（P＞0.05）。

表1 小鼠体质量和游泳时间的比较Table 1 Effect of SPD on body weight and swimming time of mice

2.2 亚精胺对小鼠骨骼肌GSH-Px、T-SOD活力和MDA含量的影响

表2 亚精胺对小鼠骨骼肌GSH-Px、T-SOD活力和MDA含量的影响Table 2 Effect of SPD on GSH-Px, T-SOD and MDA in skeletal muscle of mice

由表2可知，就小鼠骨骼肌GSH-Px、T-SOD活性而言，SPD低、中剂量组显著高于生理盐水组（P＜0.05），高剂量组亦高于生理盐水组（P＜0.05）；与西洋参组比较，SPD低、中剂量组酶活性升高明显（P＜0.05），高剂量组略微升高，但差异不显著（P＞0.05）；SPD组间比较，低、中剂量组之间提升酶活性能力无显著差异（P＞0.05），低剂量组则显著优于高剂量组，差异有显著性（P＜0.05）。

SPD组骨骼肌MDA含量均显著少于生理盐水组（P＜0.05）；SPD低剂量组消除MDA能力优于西洋参组（P＜0.05），中、高剂量组则与西洋参组相比无显著差异（P＞0.05）；SPD组间也无差异。

2.3 亚精胺对小鼠骨骼肌SDH和血清总CK含量的影响

表3 亚精胺对小鼠骨骼肌SDH活力和血清总CK活力的影响Table 3 Effect of SPD on skeletal muscle SDH and serum total CK in mice

由表3可知，SPD组骨骼肌SDH活性较生理盐水组高，低、中、高剂量组均有显著差异（P＜0.05）；SPD组与西洋参组相比，差异不显著（P＞0.05）。

SPD组血清总CK含量较生理盐水组低，差异显著（P＜0.05）；与西洋参组相比，SPD低、中剂量组差异显著（P＜0.05），高剂量组则无显著差异（P＞0.05）；SPD组间比较，低、中剂量组无显著差异（P＞0.05），低、高剂量组差异显著（P＜0.05）。

3 讨 论

随着对疲劳研究的不断深入，科学家发现疲劳的发生与身体自由基的损害及代谢产物的堆积有关[23]，Davis等[10]用电子自旋共振技术直接测定亚急性运动直到力竭的大鼠肝、肌肉匀浆中的活性氧自由基信号强度，发现其较安静组增加了2～3倍，这些自由基如果得不到及时清除，会催化形成脂质过氧化物，最终导致疲劳出现。因此，从天然物质中筛选高效、安全的自由基清除剂来延缓疲劳的发生势在必行。

3.1 亚精胺对小鼠力竭游泳时间的影响分析

力竭游泳时间被认为是最能直接反映小鼠抗疲劳能力的指标[11]，此次研究显示亚精胺能够非常显著地提高小鼠的力竭游泳时间。众所周知，西洋参含有人参皂苷，有清除自由基、降低脂质过氧化的作用，具有较明显的抗疲劳和衰老作用[9]，实验结果显示亚精胺抗疲劳能力较西洋参组更强，提示亚精胺具有良好的抗疲劳能力。亚精胺组内比较发现，随着亚精胺剂量的提高，运动时间出现下降的趋势，低剂量组与中剂量组差异不明显，与高剂量组相比差异非常显著，说明0.5～1.0 mmol/（kg·d）的亚精胺能够较好的提高机体的抗疲劳能力，更大剂量的亚精胺不能有效提高小鼠抗疲劳能力。

3.2 亚精胺对骨骼肌自由基清除的效果分 析

细胞内自由基清除酶活性的增加是机体消除自由基损害的一个重要标志，已知较为重要的自由基清除酶有GSH-Px、SOD和过氧化氢酶等。GSH-Px是肌细胞内一种重要的过氧化物分解酶，主要作用是清除细胞内的脂质过氧化物和H2O2，还原有毒性的过氧化物变成没有毒性的羟基化合物，同时特异性地催化氧化型谷胱甘肽（glutathione oxidized，GSSG）为还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH），起到保护细胞膜结构与功能完整的作用[12]。SOD是体内自由基清除系统中另一个重要的抗过氧化酶，也是唯一底物为氧自由基的酶，作用是歧化O2－·生成H2O2，阻断毒性很强的羟自由基产生，关于SOD的报道很多，已经肯定了SOD在自由基清除中的地位[13-14]。本实验结果显示，亚精胺可以非常显著的提高小鼠大强度运动后骨骼肌中GSH-Px和T-SOD的活性，其中亚精胺低、中剂量组效果最为明显，优于西洋参组。

高强度或力竭运动后，虽然机体启动了自由基清除机制，但仍不能完全被清除，过多的自由基会攻击生物膜上多元不饱和脂肪酸进而产生脂质过氧化物。脂质过氧化物可以引起生物膜的功能障碍，表现为膜通透性改变、细胞内外物质转紊乱，进而表现为线粒体功能、肌纤维兴奋收缩偶联紊乱、氧代谢能力减弱、ATP生成减少等诸多生理反应。MDA是自由基引起脂质过氧化代谢的最终产物，其含量多少直接反映体内脂质过氧化水平和抗氧化系统能力的强弱，MDA水平增高，说明体内脂质过氧化反应加大，细胞膜及线粒体等损伤加剧[15-16]。本研究结果显示，与生理盐水对照组比较，亚精胺可 以有效清除骨骼肌产生的MDA，低剂量组亚精胺较西洋参组骨骼肌MDA含量亦显著减少。可见，亚精胺可以有效增强细胞内自由基清除酶的活性，对抗自由基的产生，减少过氧化物质的生成，对维持细胞内环境的相对稳定具有重要作用。

3.3 亚精胺对生物膜保护和骨骼肌有氧代谢能力的作用分析

运动后血清CK活性变化与骨骼肌损伤之间存在一定相关性，肌细胞破坏程度越大，释放入血的CK就越多，因此血清CK活性水平成为反映骨骼肌损伤程度的重要指标[17]。有研究[18]发现人体血清CK活性随着年龄的增长而升高。另外，较少运动的老年人安静血清CK活性水平较多运动者显著增高，这与衰老过程中机体自由基含量增加不谋而合，推测自由基对细胞膜的侵害导致是血清CK含量上升的主要因素，张蕴琨等[19]的实验也证实，力竭游泳后小鼠骨骼肌内自由基生成增多，脂质过氧化物水平随之显著升高，导致肌细胞膜通透性改变，血清肌酸激酶活性明显升高。本研究发现，亚精胺组力竭游泳运动后，血清CK增长率较对照组显著降低，且与细胞MDA含量成正相关，可见血清CK含量与MDA对细胞的侵害有关，推测亚精胺对自由基的清除进而保护生物膜的完整性是血清CK活性降低的作用机理。

SDH是三羧酸循环中一个关键性酶限速酶，它属于线粒体内膜嵌入酶，SDH活性的改变反映了线粒体的功能变化，通常用来评价线粒体的有氧氧化能力。线粒体是氧自由基攻击的主要细胞器，线粒体膜功能损坏表现为SDH功能下降，该研究显示，亚精胺可以有效抑制SDH酶活性的降低，说明亚精胺可以阻止生物膜的脂质过氧化，保护细胞和细胞器功能的完整性，减少细胞内物质的丢失，减少酶活性的损失，为机体提供连续不断的能量输出，进而延缓疲劳的发生，是亚精胺抗疲劳发生的可能生理机制。

3.4 有氧训练在亚精胺抗疲劳中的作用分析

研究证明，适量强度的运动训练对清除体内自由基有积极作用，Lovlin等[20]研究发现以40%强度运动后血浆MDA浓度显著低于运动前，以70%强度运动后血浆MDA浓度虽有升高但仍然低于安静时。韩立明等[21]研究发现70 min游泳运动显著降低了小鼠脑、心、肝、肾、肌组织中MDA的含量。同时，长期有氧运动可使机体细胞产生适应性改变，这些变化包括能量和物质储备向着有利于机体机能提高的方向发展。实验通过对小鼠每天45 min的有氧训练，增加小鼠骨骼肌亚精胺的储备，增大亚精胺对机体的调节功能。该研究结果显示，亚精胺低剂量组游泳时间达到了（152.6±30）min，与杨文领等[22]复合中药制剂抗小鼠疲劳研究结果相比，对照组力竭游泳时间差别不大，而亚精胺低剂量组力竭游泳时间是中药复合制剂高剂量组的2倍多，优于相同实验条件的研究相关抗疲劳报道的时间，抗疲劳效果十分突出，说明运动训练对亚精胺抵抗疲劳有倍增效应。因此，为了最大限度的发挥外源性抗氧化剂的作用效果，采用适当强度的有氧训练是非常必要的。

4 结 论

以上结果表明，亚精胺具有极强的抗小鼠疲劳的能力，服用亚精胺可减少体内自由基的损伤，并具有显著的剂量依赖效应。因此，提高骨骼肌细胞膜代谢能力和抗损伤能力，维持正常能量输出、膜电位稳定等细胞正常功能，是亚精胺抗疲劳的可能作用机理，但其具体作用途径，调节方式等都还需要进一步研究。该研究认为亚精胺具有成为优秀抗疲劳补剂的潜质。

总结抗疲劳研究相关文献，发现大多研究还停留在单一物质的抗疲劳效果分析。抗氧化剂的作用应该是“链式”的，各种抗氧化剂通过不同途径形成链式反应而相互影响，而达到整体抗氧化的目的。所以本实验认为外源性抗氧化剂的补充应考虑抗氧化剂功能的协同作用，故加强抗氧化剂的作用的机理研究，重视各物质之间的相互作用，达到机体疲劳恢复效果的最大化成为将来抗疲劳研究的方向。

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Influence of Spermidine on Free Radical Metabolism in Skeletal Muscle and Its Anti-fatigue Effect in Mice

HE En-peng, TANG Li-li, GUO Yu-jiang
(Laboratory of Sports Science of Human Body, Xinjiang Normal University, Ürümqi 830054, China)

Objective: To explore the influence of spermidine (SPD) on the metabolism of free radicals in skeletal muscle and its anti-fatigue effect in mice. Methods: Mice were divided into negative control (normal saline), low-, middle- and high-dose SPD (0.5, 1.0 and 1.5 mmol/(kg·d), respectively) and positive control groups (A merican g inseng o ral liquid, total saponin 30 mg/(kg·d)). The administration period was 6 days per week for 5 weeks. Before each administration, body weight was measured based on which the volume of administration was determined. The mice were subjected to swimming without weight loading for 45 min each day during the administration period. Ten mice were sampled randomly from each group to examine the exhaustive swimming time. The other 10 mice in each group with 30 min swimming with loading were dissected after 30 min recovery to determine the activities of serum creatine kinase (CK) and skeletal muscle glutathione peroxidase (GSH-Px), total-superoxide dismutase (T-SOD) and succinate dehydrogenase (SDH) and skeletal muscle MDA content. Results: Compared with the negative control group, SPD could prolong the exhaustive swimming time of mice (P ＜ 0.05); The activities of GSH-Px, T-SOD and SDH were improved in skeletal muscle (P ＜ 0.05). Furthermore, the content of MDA was reduced (P ＜ 0.05). On the other hand, compared with the positive control group, low- and medium-dose SPD showed a significant difference in anti-fatigue effect (P ＜ 0.05), and high-dose SPD revealed slightly better anti-fatigue effect than American ginseng although no significant difference was observed (P ＞ 0.05). Conclusion: SPD at a dose of 0.5－1.0 mmol/(kg·d) can increase the activity of antioxidant enzymes and reduce the accumulation of free radicals. Meanwhile, SPD can improve the metabolism of skeletal muscle and prevent injuries, and delay the onset of exercise fatigue in mice significantly. Therefore, SPD is an excellent anti-fatigue tonic.

spermidine (SPD); fatigue; glutathione peroxidase (GSH-Px); malondialdehyde (MDA); succinate dehydrogenase (SDH)

R151.2

A

1002-6630（2014）09-0229-05

10.7506/spkx1002-6630-201409045

2013-05-28

国家自然科学基金地区科学基金项目（31160218）；新疆师范大学运动人体科学重点实验室 基金项目（XJNUYD07）

何恩鹏（1983—），男，讲师，硕士，主要从事运动健康促进相关研究。E-mail：heenpeng@sina.com