甘蔗主栽品种宿根矮化病调查及病原检测

张荣跃，黄应昆，李文凤，罗志明，申 科，王晓燕，尹 炯，单红丽

（云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，开远661699）

甘蔗主栽品种宿根矮化病调查及病原检测

张荣跃，黄应昆，李文凤，罗志明，申 科，王晓燕，尹 炯，单红丽

（云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，开远661699）

对中国云南和广西甘蔗主产区几个主栽甘蔗品种的宿根矮化病进行了调查和田间采样，采用PCR检测法，对田间采集的20个主栽品种的393个样本进行RSD检测。结果表明，20个主栽品种中有19个品种检测出RSD，阳性检出率9.23%～100%，393个样本中有234个样本为阳性，阳性检出率59.54%。本研究表明，云南和广西几个主产蔗区的主栽品种RSD感病严重。

甘蔗；宿根矮化病；主栽品种；病原检测

甘蔗宿根矮化病（Ratoon Stunting Disease，RSD）是一种世界性的重要甘蔗病害，由一种寄居木质部的细菌（Leifsonia xyli subsp.xyli，Lxx）引起[1]。该病于1944年首先在澳大利亚昆士兰州甘蔗品种Q28上发现[2]，现已遍布世界各蔗区。中国大陆于1986年首次确诊存在RSD[3]。蔗株染病后矮化，分蘖减少，蔗茎变细，节间缩短，一般减产12%～37%，蔗糖分降低0.5个百分点[4]。RSD没有明显的外部和内部症状，从外观难以鉴定，从而导致病害经种茎和刀具等传播蔓延，危害极大[5]。

目前对RSD有效的防治方法是生产、繁殖和推广脱毒健康种苗，而摸清蔗区RSD发生危害情况，是科学防控RSD的关键。为此，我们于2012年对云南凤庆、勐海、施甸、昌宁、盈江和广西宜州、武宣、象州等中国甘蔗主产区主栽品种的宿根矮化病进行了调查和田间采样，采用PCR检测技术进行RSD检测，分析明确这几个甘蔗主产区主栽品种的RSD发生危害情况，为推广应用脱毒健康种苗，有效防控RSD提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 病害调查与样品采集

于2012年甘蔗成熟期，对云南凤庆、勐海、施甸、昌宁、盈江和广西宜州、武宣、象州等甘蔗主产区的宿根矮化病进行了调查取样。采样选择具有代表性的主栽品种，共采集了393个样本。取样和榨汁方法参照李文凤等人的方法[6]。

1.2 PCR检测

1.2.1 蔗汁DNA的提取取4mL蔗汁，12000r/min 4℃离心15min，弃上清，沉淀加300μL灭菌双蒸水混匀；加入600μL经65℃预热的2%CTAB提取液，65℃水浴1h，期间颠倒离心管数次；加入600μL氯仿/异戊醇（24∶1）充分混匀，12000r/min离心10min；取上清，加入2/3体积的异丙醇，混匀后置于-20℃冰箱中沉淀2h；12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，室温风干后，溶于30μL ddH2O中，-20℃中保存备用。

1.2.2 PCR扩增引物序列采用文献[7]报道的RSD病原细菌Lxx 16S～23SrDNA基因间隔区特异引物，委托上海生工生物技术有限公司合成，预期扩增产物长度为438bp。其序列为：

上游引物Lxx1：5＇-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3＇

下游引物Lxx2：5＇-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3＇

PCR反应体系（20 μL）包括2×PCR Taq Master 8μL，Lxx1和Lxx2各0.2 μL，ddH2O 8.6μL，DNA 3μL。PCR扩增程序：95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，35个循环，72℃5min。

2 结果与分析

采用PCR检测法对采集的20个品种393个样本进行了检测，结果（表1）表明，20个主栽品种中除柳城03-1137检测为阴性外，其余品种ROC16、ROC20、ROC22、ROC25、粤糖00-236、粤糖79-177、粤糖86-368、粤糖93-159、桂糖02-208、桂糖02-761、桂糖11、桂糖94-119、闽糖69-421、云引3、云引58、盈育91-59、台糖95-8899、园林1、赣蔗18均检测出阳性，阳性检出率9.23%～100%；393个样本中有234个样本检测为阳性，阳性检出率59.54%；主栽品种ROC16、粤糖00-236、粤糖93-159、桂糖11、桂糖94-119等8个品种感病严重，阳性检出率高达80%以上；而ROC22、粤糖86-368和云引3号这3个品种发病较轻，阳性检出率低于20%。

3 结论与讨论

RSD是一种造成甘蔗减产、品质下降和宿根年限缩短，严重危害甘蔗产业发展的病害，在各蔗区都发生严重。沈万宽等对湛江农垦蔗区甘蔗RSD的发生情况进行了调查，RSD检出率为62.84%[8]。黄应昆等采用电镜负染法和I-ELISA对中国云南部分蔗区进行抽查，RSD检出率达69.05%[9]。邓展云等采用PCR检测法对广西部分蔗区进行抽查，其中桂糖11号RSD检出率达86%[10]。本研究明确了云南和广西几个甘蔗主产区主栽品种RSD发生危害情况，检测的20个主栽品种中有19个品种感染RSD，阳性检出率达到59.54%，由此可见，云南和广西这几个蔗区的主栽品种中RSD发生率普遍较高，已达到了相当严重的程度。

种植健康种苗是防治甘蔗RSD的主要措施，已在巴西、古巴、澳大利亚等国应用多年，甘蔗健康种苗生产方法主要有两种途径，即温水脱毒和组培脱毒。卢文洁等研究表明温水脱毒对甘蔗有明显的增产增糖效果，新植公顷增产最高49830kg，1年宿根公顷增产最高达29895kg，2年宿根公顷增产最高达23656kg，蔗糖分提高0.35%～0.86%，宿根年限延长2～3年[11]，而应用甘蔗组织培养既可去除甘蔗RSD病菌又可以脱去甘蔗病毒获得健康种苗。本研究表明，大面积主栽品种ROC16、桂糖94-119、粤糖93-159、粤糖00-236、桂糖11等品种感病严重，应重点对这几个品种进行脱毒健康种苗生产繁殖和推广应用。现有主栽品种大部分对RSD缺乏抗性或抗性不强，而本研究表明柳城03-1137、云引3号、ROC22等发病率较低，抗病性较强，是选育抗宿根矮化病甘蔗品种很有利用潜力的抗源种质，在大力推广应用的同时，可作为抗病亲本利用，选育抗宿根矮化病甘蔗新品种，供生产上推广应用。本研究结果显示了不同品种RSD感染状况，为生产繁殖推广应用脱毒健康种苗和RSD抗病资源筛选提供了科学依据。

表1 甘蔗宿根矮化病发生情况

[1]Davis MJ,Gillaspie AG,Harris RW,et al.Ratoon stunting disease of sugarcane:Isolation of the causal bacterium[J].Science,1980, 210(4476):1365-1367.

[2]McDougall WA,Steindl DRI,Elliott JT.Variations in primary vigour in the variety Q28[J].Cane Growers'Quarterly Bulletin,1948, 12:31-34.

[3]伍承芳，黄孟群.我国大陆发现甘蔗宿根矮化病[J].甘蔗糖业，1986（7）：29-30.

[4]James G.A review of ratoon stunting disease[J].International Sugar Journal,1996,98(1174):532-541.

[5]黄孟群，肖镇杰.广东甘蔗宿根矮化病调查报告[J].甘蔗糖业，1987（6）：39-40.

[6]李文凤，罗志明，黄应昆，等.云南双江蔗区甘蔗宿根矮化病的调查及病原检测[J].西南农业学报，2012，25（4）：1309-1312.

[7]Pan Y B,Grisham M P,Burner D M,et al.A polymerase chain reaction protocol for the detection of Clavibacter xyli subsp.xyli, the causal bacterium of sugarcane ratoon stunting disease[J].Plant Disease,1998,82(3):285-290.

[8]沈万宽，郑学文，陈仲华，等.湛江农垦蔗区甘蔗宿根矮化病调查研究[J].中国农学通报，2007，23（4）：387-391.

[9]黄应昆，李文凤，赵俊，等.云南甘蔗宿根矮化病病原检测[J].云南农业大学学报，2007，22（5）：25-28.

[10]邓展云，王伯辉，刘海斌，等.广西甘蔗宿根矮化病的发生及病原检测[J].中国糖料，2004（3）：35-38.

[11]卢文洁，李文凤，黄应昆，等.甘蔗温水脱毒种苗生产技术与增产效能[J].中国糖料，2010（3）：52-53.

Pathogen Detection for Ratoon Stunting Disease of Main Sugarcane Cultivars

ZHANG Rong-yue,HUANG Ying-kun,LI Wen-feng,LUO Zhi-ming,SHEN Ke,WANG Xiao-yan,et al
(Sugarcane Research Institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Kaiyuan 661699,China)

Field samplings were carried out for RSD of main sugarcane cultivars in several main sugarcane planting areas of Yunnan and Guangxi province of China,and 393 samples from 20 main cultivars were collected to detect them by PCR for RSD.The results showed that 19 cultivars were positive to RSD from 20 cultivars, positive rate were about 9.23%-100%.234 samples were positive from 393 samples,the positive rate were 59.54%.This study showed that the RSD infection of major sugarcane cultivars was serious in the main sugarcane planting areas of Yunnan and Guangxi province.

sugarcane;ratoon stunting disease;main cultivars;pathogen detection

S435.661

A

1007-2624（2014）02-0026-02

10.13570/j.cnki.scc.2014.02.009

2013-08-12

现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-20-2-2）；云南省现代农业产业技术体系建设专项资金资助。

张荣跃（1982-），男，研究实习员，主要从事甘蔗病害研究。E-mail：rongyuezhang@hotmail.com。

黄应昆（1964-），男，研究员，主要从事甘蔗病虫害防治研究。E-mail：huangyk64@163.com。