吴茱萸生物总碱提取条件的优化设计＊

吴方评，蒲艳春，杨 勇，杨宏健

(怀化医学高等专科学校，湖南 怀化 418000)

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.的干燥近成熟的果实，主要分布于贵州、广西、湖南等地，有散寒止痛，降逆止吐，助阳止泻之功效[1]，临床常用于治疗高血压、疼痛、腹泻、呕吐等症[2-5]。吴茱萸含有多种化学成分，目前从中提取的主要有挥发油、苦味素和生物碱等。现代药理学研究认为，吴茱萸碱、吴茱萸次碱是吴茱萸中的重要药理活性成分，具有保护心脏[6-8]、抑制血栓形成[9]、抗癌[10]和抗菌[11]等作用。鉴于吴茱萸碱、吴茱萸次碱的生物活性，许多学者对其进行了大量提取方法的探索，但所用方法普遍存在工艺复杂、溶剂消耗量大、提取成本高等缺点。由于微波提取具有其他方法不可比拟的优势，本试验中优选了吴茱萸生物总碱的最佳提取条件，现报道如下。

1 仪器与试药

MENS 型中药微波萃取仪;Agilent 1200 型单元泵高效液相色谱仪;可变波长检测器;FA2004 型电子天平(上海方瑞仪器有限公司);索式提取器;干燥器等。吴茱萸碱对照品(批号为110802 -200606)、吴茱萸次碱对照品(批号为110801 -201006)，均购自中国药品生物制品检定所;乙腈、甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)均为色谱纯;石油醚、无水乙醇(天津市富宇精化工有限公司)均为分析纯;二次蒸馏水。共收集不同产地的吴茱萸果实5 批，经专家鉴定，均为芸香科植物吴茱萸的成熟果实。不同产地的吴茱萸样品信息见表1。

表1 不同产地样品信息

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱:Agilent Eclipse XDB - C18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm);流动相:水-甲醇-乙腈(42 ∶20 ∶38);进样量:20 μL;流速:0.5 mL/min;检测波长:240 nm。

2.1.2 样品处理及溶液制备

取吴茱萸原料，于80 ℃烘箱中干燥2.5 h，粉碎，过筛，索氏提取脱脂2 h，晾干，精密称取脱脂吴茱萸0.1 g，置250 mL 聚四氟乙烯消化罐中，加入提取溶剂，润湿40 min，于中药微波萃取仪中提取，放置室温，转移至50 mL 容量瓶中，用提取溶剂定容至刻度，进样前用0.45 μm 针头过滤器过滤，作为供试品溶液。分别精密称取对照品吴茱萸碱1.9 mg 和吴茱萸次碱1.6 mg，置10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制备成质量浓度分别为0.19 g/L和0.16 g/L 的吴茱萸碱对照品溶液和吴茱萸次碱对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

系统适用性试验:按拟订色谱条件进行试验，结果吴茱萸碱和吴茱萸次碱分离良好，无杂质干扰，见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:分别精密抽取吴茱萸碱对照品溶液(0.19 g/L)和吴茱萸次碱对照品溶液(0.16 g/L)1，2，4，8，16 μL，按拟订色谱条件依法进样，记录色谱峰。结果吴茱萸碱质量浓度在4.00 ～128.00 μg/mL 之间、吴茱萸次碱质量浓度在4.75 ～152.00 μg/mL与峰面积呈良好线性关系，吴茱萸碱与吴茱萸次碱的回归方程分别为Y=196 658 X(r=0.999 6);Y=278 868 X，(r=0.999 0)。

精密度试验:取上述2 种对照品溶液各1 mL，置10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，分别依法同体积重复进样5 次。结果吴茱萸碱的RSD 为0.72%，吴茱萸次碱的RSD 为0.85%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:精密称取湖南产样品0.1 g，依法制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8 h 时进样，测定吴茱萸碱和吴茱萸次碱的峰面积。结果吴茱萸碱的RSD 为1.51%，吴茱萸次碱的RSD 为0.93%，表明供试品溶液在8 h 内稳定。

加样回收试验:分别称取不同产地已知吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量的吴茱萸样品各5 份，依法处理并进样测定，计算回收率。结果见表2。

2.2 提取溶剂选择

试验研究了乙酸乙酯、丙酮、不同浓度的乙醇和甲醇等溶剂对吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取率的影响，在以微波提取功率400 W、提取时间8 min、溶剂倍数1 ∶200 的条件下。结果以90%乙醇为提取溶剂提取效果最佳。

2.3 提取工艺正交试验设计

将吴茱萸粉末用索氏提取器提取2 h，取出，干燥，再精密称取0.1 g 吴茱萸粉末，置250 mL 聚四氟乙烯样品瓶中，用90%乙醇密封浸润40 min，在微波萃取仪中进行提取，提取液转移至50 mL容量瓶中，用提取液定容至刻度，用0.45 μm 针头过滤器过滤。

表2 吴茱萸碱和吴茱萸次碱加样回收试验结果(n=5)

设计L9(34)正交试验，在用90%乙醇为溶剂的前提下，考察提取功率(因素A)、提取时间(因素B)、料液比(因素C)、颗粒粒径(因素D)等因素对提取率的影响。正交试验因素和水平见表3，按正交试验设计提取吴茱萸碱和吴茱萸次碱，结果及极差分析见表4，方差分析见表5。

表3 正交试验的因素水平表

表4 提取工艺正交试验结果及极差分析

表5 正交试验方差分析表

极差分析数据表明，对于吴茱萸碱，提取功率为400 W，提取时间为6 min，溶剂倍数为1 ∶100 时，提取率较高，颗粒粒径对提取率影响不大;对于吴茱萸次碱，提取功率为400 W，提取时间为6 min，溶剂倍数为1 ∶100 时提取率较高，颗粒粒径对提取率影响不显著。方差分析结果显示，溶剂倍数、提取功率、提取时间和颗粒粒径对吴茱萸碱和吴茱萸次碱影响不大。综合极差和方差分析，同时考虑到经济因素，提取吴茱萸碱的最佳条件为A2B3C1D3，提取吴茱萸次碱的最佳条件为A2B3C1D2，考虑到粒度对吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取率影响较小。综合以上因素，选定提取吴茱萸碱和吴茱萸次碱的最佳条件为A2B3C1D2，即提取功率为400 W，提取时间为6 min，溶剂倍数为1 ∶100，颗粒粒径为0.150 mm。

2.4 各产地吴茱萸总生物碱含量提取比较

分别取重庆、广西、青岛、北京同仁堂、湖南5 个产地的吴茱萸药材，按2.3 项下方法操作进行提取，条件为A2B3C1D2，按拟订色谱条件进样分析，结果见表6。可见，广西产吴茱萸提取的吴茱萸生物总碱最多。

表6 吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱稳定性试验结果

3 讨论

在溶剂选取中，分别选用乙酸乙酯、丙酮、5 个不同浓度的乙醇和甲醇作为微波提取溶剂。结果表明，90%乙醇提取率较高，故选取90%乙醇作为提取溶剂;提取时间适当延长，微波提取功率适当增大，对提取率有利，但提取时间过长，提取功率过大，温度升高过快，溶剂挥发较大，提取率反而降低;样品粒度对提取率影响较小。综合以上因素，试验选定提取吴茱萸碱和吴茱萸次碱的最佳条件为A2B3C1D2，即提取功率为400 W，提取时间为6 min，溶剂倍数为1 ∶100，颗粒粒径为0.150 mm。试验结果表明，上述条件比传统的提取方法有提取时间更短，生物碱的转移率更高等优点，可用于吴茱萸中吴茱萸生物总碱的提取。

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