玉米胚芽抗氧化肽的急性毒性和致突变性

张鸣镝，赵会燕，刘静波*，王 莹，赵骏捷，孙晓萌

（吉林大学军需科技学院，吉林 长春 130062）

玉米胚芽抗氧化肽的急性毒性和致突变性

张鸣镝，赵会燕，刘静波*，王 莹，赵骏捷，孙晓萌

（吉林大学军需科技学院，吉林 长春 130062）

研究玉米胚芽抗氧化肽在小鼠体内的急性毒性及致突变性，为其开发应用提供安全保障。采用最大耐受量法、小鼠精子畸形实验、骨髓微核实验和Ames实验对玉米胚芽抗氧化肽进行急性毒性和致突变性研究。结果表明：玉米胚芽抗氧化肽对小鼠的急性经口最大耐受剂量（maximum tolerated dose，MTD）大于34 g/kg（以体质量计）；3 项致突变实验结果均为阴性，故玉米胚芽抗氧化肽无急 性毒性和致突变性。

玉米胚芽抗氧化肽；精子畸形；骨髓微核；鼠伤寒沙门氏菌回复突变实验（Ames实验）

玉米胚芽粕是玉米油厂生产加工过程中产生的主要副产物[1]，富含多种人体所必需的氨基酸、多糖和膳食纤维，其粗蛋白含量约为23%[2]，是一种极好的植物蛋白资源。玉米胚芽蛋白具有良好的功能特性[3-6]，国内外多利用玉米胚芽蛋白作为食品添加剂，广泛应用于肉制品[7-8]、糕点[9-10]和饮料[11-13]的生产加工中。自由基理论认为随着年龄增长，体内抗氧化酶活力下降，过多的自由基影响细胞物质和能量代谢的正常进行，导致衰老、肿瘤、心血管疾病、免疫功能低下等很多退行性疾病[14-15]。随着人民生活水平日益提高，人们对高效、低毒的抗氧化物质的诉求也日益增大。因此，对抗氧化肽的研究成为近年来学者们关注的重点课题。

玉米胚芽抗氧化肽是以玉米胚芽粕制备的玉米胚芽蛋白为底物，采用生物酶酶解技术制备的混合肽，具有消化吸收快、水溶性好和抗氧化等良好的功能特性，其分子质量主要分布在145.56～3 844.47 D[16]。目前工业上多采用湿法脱胚和压榨法、浸出法相结合的方式提取玉米胚芽油[17]，故玉米胚芽粕中可能残留二氧化硫和其他有机溶剂。并且提取玉米胚芽蛋白时通常采用较高浓度的氢氧化钠，强碱的使用容易引发“胱赖反应”从而产生有毒物质。因此，对玉米胚芽抗氧化肽进行系统的毒理学评价具有深远的现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米胚芽抗氧化肽 吉林大学军需科技学院营养与功能食品研究室自制。

实验动物配合饲料，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，许可证编号（SCXK-（吉）2010-0001）；鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 上海桑戈生物科技有限公司；伊红（醇溶） 天津市瑞金特化学品有限公司；小牛血清 杭州四季青生物材料研究所；快速姬姆萨染液 南京建成科技有限公司；甲醇、氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸一氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸氢钠铵、硫酸镁均为分析级 北京化工厂；环磷酰胺、L-组氨酸、D-生物素、辅酶-Ⅱ（氧化型）、葡萄糖-6-硫酸钠、浆液、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、2-氨基芴（2-amino fluorene，2-AF）、敌克松（dexon fenaminosulf，DAPA）、甲基磺酸甲酯（methyl mathanesulfonate，MMS）、1,8-二羟基蒽醌（1,8-second hydroxyl anthraquinone，1,8-HAQ） 美国Sigma公司。

1.2 实验动物和饲养环境

急性毒性实验：体质量（20±2）g，雌雄各半，共40 只；小鼠精子畸形实验：体质量（30±5）g，雄性，共25 只；骨髓微核实验：体质量25～30 g，雌雄各半，共50 只。以上实验用鼠均为SPF级ICR小鼠，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供。本实验中，动物饲养室环境温度控制在（22±2）℃、相对湿度控制在（50±5）%、换气频率≥10 次/h、采用12 h光照/黑暗并控制噪音小于60 dB。

1.3 方法

1.3.1 小鼠急性毒性实验[18]

采用国标中最大耐受剂量（maximum tolerated dose，MTD）法，根据玉米胚芽抗氧化肽的溶解性及其在注射器中的可流动性为指标，确定受试物的使用质量浓度为0.85 g/mL。实验小鼠在适应环境3 d后按照体质量随机分为2 组，即实验组和空白对照组。首次灌胃前，实验小鼠隔夜空腹16 h，自由饮水。采用经口灌胃的途径对实验组小鼠给予受试物，按国标要求每次实验小鼠的灌胃体积为0.2 mL/10 g（以体质量计，下同）。本实验中2 次给予小鼠受试物，时间为上午8：00和12：00，故实验组最终累计给予玉米胚芽抗氧化肽的量为34 g/kg；给予空白对照组小鼠相同体积的蒸馏水[19]，灌胃2 h后，重新给予食物。给予受试物后密切观察并记录实验小鼠的生理活动表现。观察期间不限制摄食和饮水，每天记录实验小鼠的体质量、摄食量和饮水量。7 d后采用脊椎脱臼法处死所有存活的实验小鼠（处死前禁食4 h），迅速解剖并收集心脏、肝脏、肾脏、胸腺、肺、脾、肾、睾丸、附睾等脏器，称其质量并计算脏器系数。对有明显病变的实验小鼠进行组织病理学检查。

1.3.2 小鼠精子畸形实验[20]

实验小鼠在适应环境4 d后按照体质量随机分为5 组，即阴性对照组，玉米胚芽抗氧化肽低、中、高剂量组和阳性对照组。实验中选取10 g/kg为最高给药剂量，再下设中剂量5 g/kg、低剂量2.5 g/kg，阴性对照组给予相同体积的蒸馏水，阳性对照组给予40 mg/kg的环磷酰胺。连续5 d经口灌胃，首次灌胃后的第35天用颈椎脱臼法处死实验小鼠，将两侧附睾取出，常规制备小鼠精子涂片。在高倍镜下观察，每只实验小鼠各检查结构完整的精子1 000 个，记录畸形精子数并计算精子畸形率。

1.3.3 小 鼠骨髓微核实验[21]

实验小鼠在适应环境4 d后按照体质量随机分成5 组，即阴性对照组，玉米胚芽抗氧化肽低、中、高剂量组和阳性对照组。选取10 g/kg为最高给药剂量，再下设中剂量5 g/kg、低剂量2.5 g/kg。阴性对照组给予相同体积的蒸馏水，阳性对照组给与40 mg/kg的环磷酰胺。本实验采用30 h给予受试物法，即早8：00第一次给予玉米胚芽抗氧化肽，隔天早8：00第二次给予，当日14：00颈椎脱臼处死小鼠，迅速取出胸骨，常规制备骨髓涂片。在油镜下观察计数1 000个嗜多染红细胞（polychromatic erythrocyte，PCE）中的微核数，计算微核率。

1.3.4 鼠伤寒沙门氏菌回复突变实验（Ames实验）[22]

将玉米胚芽抗氧化肽在紫外灯下辐照杀菌15 min后，溶于DMSO。实验中设置玉米胚芽抗氧化肽含量分别为8、40、200、1 000、5 000 øg/plate共5 个剂量组，分别为实验组A、B、C、D、E。阳性对照组分别是：加S9活化系统时，TA97、TA98、TA100均使用2-AF，剂量是10 øg/plate，TA102使用1,8-HAQ，剂量是60 øg/plate；不加S9活化系统时，TA97、TA98、TA102均使用DAPA，剂量是50 øg/plate，TA100使用MMS，剂量是1 øL/plate。本实验采用平板掺入法，同时设置5 个实验组，阳性对照组、阴性对照组和溶剂对照组。每一菌株的每一剂量组均做3 个平行皿，37 ℃培养48 h后观察每个培养基上回变菌落数。若各实验组的回变菌落数目是阴性对照组的2 倍以上，并具有一定的剂量反应关系或至少某一测试点有可重复的并有统计学意义的阳性反应，则可判定实验结果为阳性，该受试物具有致突变性。

1.4 数据处理及统计

小鼠急性毒性实验中采用SPSS 19.0数据处理软件独立样本t检验，置信区间百分比为95%；其他3项致突变实验中均采用SPSS 19.0软件进行数据处理，设置P=0.05，对实验数据均值进行单因素方差分析。先对数据进行方差齐性检验，若方差齐性，则选用LSD法进行多个剂量组与对照组实验数据均值间的两两比较，若方差不齐则选用Dunnett’s T3法进行数据的两两比较。

2 结果与分析

2.1 小鼠急性毒性实验结果

2.1.1 一般观察结果

给予小鼠玉米胚芽抗氧化肽后，实验小鼠未见明显中毒现象，7 d内无小鼠死亡。实验期间，观察并记录实验小鼠的体质量、摄食量和饮水量，计算小鼠急性毒性实验中小鼠总食物利用率，具体结果见表1～3。由结果可知：空白对照组与实验组的体质量、摄食量和饮水量均无显著性差异。故玉米胚芽抗氧化肽的摄入没有诱使受试小鼠产生食欲不振等现象，不影响小鼠的正常生长发育。

表1 急性毒性实验小鼠体质量变化（x±s，n=10）Table 1 Changes in body weight of mice in acute toxicity test (x±s，n=10) g

表2 急性毒性实验小鼠日摄食量和日饮水量变化（x±s，n=10）Table 2 Changes in daily intake and water intake of mice in acute toxicity tesstt (x ±s, n=10)

表3 急性毒性实验小鼠食物利用率（x±s，n=10）Table 3 Food utilization of mice in acute toxicity test (x±s，n=10)

2.1.2 脏器系数分析

实验第8天处死小鼠，解剖检查各脏器无明显异常，剥离脏器称质量，计算脏器系数结果如表4，玉米胚芽抗氧化肽的摄入并未对实验小鼠的脏器造成病变性的影响。

综上所述：玉米胚芽抗氧化肽对雌雄小鼠的MTD值均大于34 g/kg，根据急性毒性分级标准，属于实际无毒物质。

2.2 小鼠精子畸形实验结果

表5 小鼠精子畸形实验结果（x±s，n=5）Table 5 Results of sperm abnormality test for mice (x±s，n=5)

玉米胚芽抗氧化肽3 个剂量组的精子畸形率实验结果如表5所示，经统计学检验结果可知：实验组与阴性对照组比较均无显著性差异（P＞0.05）；与阳性对照组比较有显著性差异（P＜0.05）。故玉米胚芽抗氧化肽无诱发小鼠精子畸形的作用。

2.3 小鼠骨髓微核实验结果

由表6可知，相较于阴性对照组，玉米胚芽抗氧化肽的3 个剂量组的骨髓微核率均无显著性差异（P＞0.05），而阳性对照组（环磷酰胺组）具有极显著差异（P＜0.01）。本实验系统对诱变化合物敏感，且玉米胚芽抗氧化肽无诱使小鼠骨髓微核嗜多染红细胞增加的作用。

表6 小鼠骨髓微核实验结果（x±s，n=5）Table 6 Results of bone marrow cell micronucleus test for mice (x ±s,n=5)

2.4 Ames实验结果

表7 玉米胚芽抗氧化肽Ames实验结果（x ±s，n=3）Table 7 Results of of Ames test (x ±s,n=3)

由表7可知，玉米胚芽抗氧化肽每皿剂量在8～5 000 øg/plate时，有或者没有S9代谢活化系统对4 种菌株的平均回变菌落数均未超过阴性对照组的2 倍，并未见剂量反应关系，而阳性对照组在相同实验条件下，均显现出阳性反应。以上情况充分说明玉米胚芽抗氧化肽无致突变作用。

3 结3 论

本实验为探讨玉米胚芽抗氧化肽的安全性，对其进行了急性毒性实验和3 项致突变实验。结果表明玉米胚芽抗氧化肽属实际无毒物质，并且3 项致突变实验均表明玉米胚芽抗氧化肽不具有诱发突变的作用。本实验中的玉米胚芽抗氧化肽的人体推荐日用量为3.6 g/（人•d），假设人的标准体质量为60 kg，则推荐摄入量（以体质量计）相当于60 mg/（kg•d）。采用的最高剂量远远大于人体推荐摄入量的100 倍，说明玉米胚芽抗氧化肽在推荐剂量范围内使用是安全的。本结果为玉米胚芽抗氧化肽的产业化开发提供理论依据。

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[21] 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所. GB 15193.5—2003 骨髓微核试验[S]. 北京: 中国标准出版社, 2003.

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Acute Toxicity and Mutagenicity of Corn Germ Antioxidant Peptide

ZHANG Ming-di, ZHAO Hui-yan, LIU Jing-bo*, WANG Ying, ZHAO Jun-jie, SUN Xiao-meng
(College of Quartermaster Technology, Jilin University, Changchun 130062, China)

In order to provide safety guarantee for its development and application, the acute toxicity and mutagenicity of corn germ antioxidant peptide (CGAP) in mice were evaluated by testing maximum tolerable dose (MTD), and mutagenicity of CGAP was studied by sperm abnormality test, bone marrow cell micronucleus test and Ames test. The results showed that MTD of CGAP was larger tha n 34 g/kg in mice and all the results of mutagenicity tests obtained were negative. Thus, CGAP does not show any acute toxicity or mutagenicity.

corn germ antioxidant peptide; sperm abnormal ity; bone marrow cell micronucleus; Salmonella typhimurium reverse mutation test (Ames test)

TS201.6

A

1002-6630（2014）13-0228-04

10.7506/spkx1002-6630-201413044

2014-05-29

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD33B03）；国家自然科学基金面上项目（31271907）；高等学校博士学科点专项科研基金（博导类）项目（20130061110088）

张鸣镝（1971—），男，副教授，博士，研究方向为营养与功能食品。E-mail：zhangmd@jlu.edu.cn

*通信作者：刘静波（1962—），女，教授，博士，研究方向为营养与功能食品。E-mail：ljb168@sohu.com