三孢布拉氏霉发酵产β-胡萝卜素的研究进展

尹金凤，王志轩，吴欣森，李泓全，徐大刚*，童海宝，董宏伟*

（上海化工研究院，上海 200062）

β-胡萝卜素是生物体内合成VA的前体物质，为许多具有鲜亮颜色的动、植物组织中的主要色素成分。迄今为止，它是类胡萝卜素家族中研究最为充分的一种四萜化合物。经研究发现，该化合物有抗氧化、促进动物组织发育、提高免疫力以及抗癌等多种生物活性[1]。近年来，由于β-胡萝卜素的生物功能日益明晰，有关β-胡萝卜素的相关研究也备受重视。

目前，β-胡萝卜素的主要生产方法有化学合成法、植物提取法、盐藻萃取法和生物合成法。其中化学合成法生产成本低廉，但由于产品存在有害物质残留问题，因此成为限制其应用的瓶颈。植物提取法是最早发现β-胡萝卜素的方法，也是早期获取天然β-胡萝卜素的重要手段[2]。有文献报道[3]，目前已研究培育出β-胡萝卜素含量比较高的胡萝卜新品系，可以为天然β-胡萝卜素的生产提供优质原料。但由于胡萝卜生产容易受到地理、气候、时间和空间的限制，因此很难实现廉价β-胡萝卜素的大规模工业制备。杜氏盐藻（Dunaliella salina）培养是获取天然β-胡萝卜素的另一重要来源[2]。但由于盐藻培养需要强烈的光照和高浓度的盐分，因此对生产的气候条件和地理环境提出了极高的要求；另外，该生产过程通常为开放式培养，因此生产过程控制困难，产品品质难以保障。微生物发酵生产天然β-胡萝卜素由于不受光照、气候、产地等环境条件的限制，加之产品具有经济、安全和着色力强等优势，因此该技术受到国内外市场的广泛青睐。

三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）具有生长迅速、生物量大、单位菌体β-胡萝卜素产量高等明显优势，是生产天然β-胡萝卜素的理想菌株，在东欧早已应用于工业化生产[4]。该霉菌属于接合菌纲、毛霉目、笄霉科、布拉氏霉菌属，有正负两种菌株，能产生发达的菌丝，为长管单细胞低等真菌。正负菌单独培养时，表现为菌丝的延长和分支，细胞核的裂殖增多，以及细胞质的增加。在此过程中，两种菌株只能合成少量的类胡萝卜素，并无性繁殖生成孢子囊和孢囊孢子[5-6]。除此之外，正负菌株也可异宗结合，并通过有性繁殖形成接合孢子[7-8]。有研究表明，接合孢子的形成与β-胡萝卜素合成有密切关系。在正负菌混合发酵过程中，性激素类物质——三孢酸（也曾命名为β因子）的大量生成，对三孢布拉氏霉菌合成β-胡萝卜素起到重要的促进作用[9]。

基于三孢布拉氏霉菌的生理、结构和代谢特点，在其诱变选育与β-胡萝卜素发酵的研究中逐渐形成了较为独特的技术体系。本文从菌种选育及发酵工艺优化等角度，对三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素技术的研究进展进行了概述，并对其研究趋势和发展方向进行了展望。

1 1 β-胡萝卜素高产菌株的选育

三孢布拉氏霉菌为典型低等真菌的细胞结构，即无隔膜的丝状真菌[10]。为了方便诱变及后续处理操作，通常以三孢布拉氏霉孢子作为处理对象，并利用各种化学和物理手段对正负菌孢子分别进行诱变处理。为实现菌种选育工作的高效实施，逐渐根据三孢布拉氏霉菌的生理和代谢特点，形成了独具特色的诱变和筛选技术体系，也为进一步建立三孢布拉氏霉菌高通量育种技术体系奠定了基础。

1.1 三孢布拉氏霉菌分离筛选技术的研究进展

三孢布拉氏霉菌孢子涂布于PDA固体培养基表面后，孢子会萌发长出菌丝体并不断的延伸以及分枝，无法形成规则且界限清晰可辨的圆形菌落。以大小为9 cm的常规筛选平板为例，当平板上的菌落数量超过10个以上时，三孢布拉氏霉极易因菌丝体的蔓延而导致菌落间的相互交叉，从而无法保证菌株分离纯化的效果。

有关三孢布拉氏霉菌落分离纯化技术的研究，最早见于1977年。Kharabrova等[11]首次通过应用麦芽汁琼脂双层平板，从而使得三孢布拉氏霉菌在固体培养基的生长方式，从连续性菌丝蔓延生长转变为菌落型聚集生长。在一定程度上，该方法有效地解决了三孢布拉氏霉菌落分离纯化的技术问题。在改善工作效果和提高工作效率的同时，也有效降低了实验操作人员的工作量。

另据文献报道[12-13]，脱氧胆酸钠作为一种离子型表面活性剂，可以通过改变菌体细胞膜的通透性而发挥抑制真菌菌丝体生长的作用。在三孢布拉氏霉菌落的筛选过程中，脱氧胆酸钠可使菌体在固体培养基表面形成较为规整和界限清晰的圆形菌落。早在1995年的1 项国际专利中，Finkelstein等[14]就开始将该技术应用于三孢布拉氏霉诱变后孢子的筛选操作。在国内，刘海丽等[12]在固体筛选培养基添加聚乙二醇辛基苯基醚（乳化剂OP）或脱氧胆酸钠，并对两种抑制剂的应用效果进行了比较。结果发现，乳化剂OP对三孢布拉氏霉菌体生长的抑制效果较为强烈（最适剂量0.5 g/L），脱氧胆酸钠对菌体细胞的抑制作用相对较小（最适剂量0.75 g/L）。具体表现为：脱氧胆酸钠固体培养基表面的气生菌丝数量与菌落数量略高于含有乳化剂OP的筛选平板[12]。

1.2 高产β-胡萝卜素菌诱变技术的研究进展

诱变技术，即通过各类物理、化学和辐照等手段，而引起物种的遗传变异[15]。基于三孢布拉氏霉自身的生理和代谢特点，长期诱变选育工作中积累的研究经验又反馈于诱变方案的设计，并发展出具有针对性的诱变技术。

1.2.1 化学诱变技术及其在三孢布拉氏霉菌组合诱变中的应用

化学诱变技术是一种简便易行广泛应用的生物物种诱变技术。在1995年的国际专利中，Finkelstein等[14]就建议可以利用1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，NTG）、甲基磺酸乙酯（ethylmethane sulfonate，EMS）、亚硝酸，核苷酸类似物，吖啶类化合物（acridines）等多种化学诱变剂，并可结合紫外线（UV）、X射线、γ射线等诱变技术，对三孢布拉氏霉菌进行遗传选育。在其具体实施中，主要采用以EMS、UV，尤其是50～500 μg/mL的NTG对三孢布拉氏霉菌负菌株（ATCC 14272）进行反复多轮诱变筛选，并最终使得β-胡萝卜素的发酵水平由2.7 g/L最高提至7.0 g/L。

此外，Mehta等[6,16]以NTG对三孢布拉氏霉正负菌孢子（正菌F986和负菌F921）进行处理，并获得高产突变菌株（正菌SB39、负菌SB32）。通过采用正负菌混合培养，突变株菌丝体β-胡萝卜素含量（（28.2±5.8）mg/g菌体干质量）相对初始正负菌株（（4.3±1.1）mg/g菌体干质量）提高了约6倍。Perez等[17]则采用UV、EMS、亚硝酸和NTG对三孢布拉氏霉菌孢子（正菌VKPM F-117、负菌VKPM F-208）进行多次诱变，得到正负高产菌株（正菌CPA1、负菌CMA3和CMB2）。通过配对发酵，正菌CPA1与负菌CMA3配对发酵产量为7.2 g/L，正菌CPA1与负菌CMB2配对的发酵产量为6.8 g/L；随后通过发酵工艺优化，β-胡萝卜素发酵水平最高达到9.0 g/L。在国内，任双喜等[18]采用UV、NTG和离子束对三孢布拉氏霉菌负菌N-1孢子进行综合诱变处理处理，获得三孢布拉氏霉菌优良负菌株（SCB201）。通过与正菌（SCB200）进行配对发酵实验，诱变高产菌株的β-胡萝卜素发酵水平达到2.0 g/L，比出发菌株发酵水平（0.2 g/L）提高9倍。

根据以上的相关研究报道分析可知，尽管目前可以有效引起生物物种遗传物质产生变异的化学诱变剂多种多样，但由于部分诱变剂属于剧毒化学品，危害以及监管难度较大（例如二氯二乙烷、叠氮化钠等），无法作为常规的诱变剂进行使用。在长期的三孢布拉氏霉菌选育工作中，NTG、EMS和亚硝酸等化学诱变剂由于使用安全性略高（国际癌症研究机构2A类致癌物，http://monographs.iarc.fr/ENG/Classification/），因此成为该领域主要的化学诱变手段。其中，NTG更是实际应用过程中最为有效和常用的化学诱变剂。随着近年来对于公共安全、劳动卫生和安全防护等意识的日益提升，类似NTG等高效化学诱变剂的实验操作防护、使用和后处理方面的监管也应不断加大。基于NTG等化学诱变剂对实验操作人员身体健康威胁的考虑，需要在实验防护、实验过程中废弃物处理、以及实验过程的管理等方面提出严格规范的规程，从而更好地发挥化学诱变技术在生物物种诱变选育中的作用。

1.2.2 物理诱变技术及在三孢布拉氏霉菌组合诱变中的应用

与化学诱变技术相比，物理诱变技术由于不存在诱变剂的残留问题，因而极大方便了诱变后的筛选和选育操作。目前主要应用于三孢布拉氏霉菌株选育的物理诱变技术有：UV诱变、60Co辐照诱变、离子束诱变等。

UV诱变技术是一种极为简便且易于推广的物理诱变技术。例如，顾秋亚[19]采用传统的UV诱变方法，并利用含有0.025%洛伐他汀和0.05% OP乳化剂的抗性平板对三孢布拉氏霉菌负菌进行定向选育，从而得到一株高产β-胡萝卜素的菌株，其产量为2.06 g/L，比原始菌株提高了49.3%。另外，由于UV主要通过引起DNA大分子中相邻的嘧啶形成二聚体，因此主要造成点突变或者局部的DNA分子损伤，加之生物体细胞内具有多种针对DNA点突变损伤的修复机制，因此该方法的实际诱变效率较低。在β-胡萝卜素高产菌株的诱变选育工作中，该方法多以组合应用的形式，应用于三孢布拉霉孢子的诱变处理操作中（详见1.2.1节）。

除UV诱变技术之外，常见用于三孢布拉氏霉诱变处理的物理诱变技术还包括：60Co辐照以及离子束处理诱变技术等。该类方法主要是以γ射线以及高能的快中子（10～100 keV）对三孢布拉氏霉孢子中的DNA分子造成大范围的损伤，从而引起遗传物质的缺失和重排[20]。童海宝等[21]曾使用60Co辐照等诱变技术对三孢布拉氏霉菌进行了诱变处理，并取得良好的诱变效果。

离子束诱变技术在我国最早于1997年由中国科学院等离子体物理研究所建立，并由邵春林等对离子束辐照引起的生物效应，从能量、质量、电荷三方面建立了协同效应模型（EMC模型）[22]。对于该技术在生物物种改良中的应用及研究进展，周长芳、张宁等[20-23]皆曾进行过系统的论述。国内利用离子束技术对三孢布拉氏霉菌进行选育的研究，最早见于任双喜等[18]的相关报道（详见1.2.1节）；除此之外，张宁等[24]也以10 keV的低能氮离子（N+）注入三孢布拉氏霉菌孢子，并筛选得到两株改良菌株。突变株的β-胡萝卜素发酵水平达到2.2 g/L，比出发菌株提高20%。随后，Zhang Ning等[25]又对三孢布拉氏霉负菌CK03孢子进行低能氮离子注入诱变选育，获得两株优良性状的菌株（BH3-701和BH3-728），突变株的β-胡萝卜素发酵水平从1.835 g/L分别提升至3.280 g/L和3.021 g/L。

此后，Zhang Ning等[26]从抗氧化酶酶活水平上，对低能离子束剂量与三孢布拉氏霉菌孢子存活率之间的关系进行了解析，初步证实孢子极可能借助过氧化物酶和超氧化物歧化酶对自由基的清除，降低离子束辐照对孢子的损伤。该研究结果为改进离子束在诱变中的应用起到重要的指导作用[27]。

1.2.3 原生质体技术在三孢布拉氏霉菌选育中的应用

由于三孢布拉氏霉菌细胞及其孢子具有坚韧的细胞壁和孢子壁结构，因此为细胞抵御化学诱变剂提供了一个天然的“屏障”。有效地去除三孢布拉氏霉菌细胞壁和孢子壁，可以提高菌体细胞遗传物质对物理和化学诱变剂的敏感性，有可能获得意想不到的诱变效果。

早在1999年，单志萍等[28]就曾对三孢布拉氏霉原生质体的制备及再生技术进行了系统的研究。通过利用溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶进行组合优化，使得原生质体制备浓度达到8.0×106个/mL；随后，借助于原生质体液体再生技术，使得原生质体再生率达到40%。2002年，该课题组又利用高浓度NTG（100 μg/mL）对三孢布拉氏霉JMβ817孢子进行处理，从而得到功能上为单核的孢子，并以此为基础进行原生质体的制备。通过对原生质体进行UV诱变处理和再生，得到深黄色的突变株。其β-胡萝卜素产量达到2.36 g/L，比出发菌株提高了30%[29]。2007年，邬春艳[30]通过三孢布拉氏霉菌原生质体的制备，并利用UV诱变以及原生质体融合技术，从而获得1株具有优良遗传稳定性的重组菌株。

除此之外，国内外学者利用原生质体制备技术，也对三孢布拉氏霉菌的基因工程研究进行了大量的研究探索。2008年，Li Ye等[31]利用蜗牛酶、纤维素酶和溶菌酶进行复配，成功制备了三孢布拉氏霉菌原生质体。原生质体制备浓度为7.48×106个/mL，再生效率达到（77.5±2.70）%。基于原生质体转化技术，外源GFP编码基因的表达以及RNA干扰技术相继在三孢布拉氏霉体系得以实现。2011年，黄琼瑶[32]又尝试利用原生质体转化技术，以实现雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）β-胡萝卜素羟化酶基因（crt-Z）和酮化酶基因（crt-W）在三孢布拉氏霉中的表达。但由于原生质体再生效率较低（制备效率约为2.2×106个/mL），因此该法的应用效果与农杆菌及基因枪介导的基因转化方法尚有一定的差距。

由此可见，虽然各课题组制备三孢布拉氏霉菌原生质体的制备效率皆达到相同的技术水平，原生质体的再生效率水平却高低不一，原生质体技术在三孢布拉氏霉菌菌种选育的应用尚属起步探索阶段。系统的开展原生质体制备及其对再生效率影响的研究，提高所获原生质体的存活率，将是推动该技术在三孢布拉氏霉菌育种与代谢工程相关研究的重要发展方向之一。

根据三孢布拉氏霉菌诱变选育技术的研究报道分析可知，该领域的发展方向除不断尝试和开发各类诱变技术外，其应用过程更以NTG化学诱变为主要手段，并以此形成各类物理和化学诱变技术组合应用的发展特点。由于三孢布拉氏霉菌为多核真菌的特点，通过较高的诱变剂量（例如NTG使用的浓度剂量），可以通过提高孢子致死率的方式，破坏大多数细胞核维持细胞正常生理代谢的功能[6,16]，并以此确保突变株的遗传稳定性。如能在分子水平上揭示三孢布拉氏霉菌生长及孢子形成过程中的细胞核复制及调控基本规律，通过基因工程或者各类调控手段获取单核或者少核的菌株孢子，将对三孢布拉氏霉菌的诱变育种工作产生积极的促进作用。

1.3 三孢布拉氏霉菌选育过程中高效筛选技术的应用

选择性培养基是一类根据某种微生物的特殊营养要求或抗性而设计的培养基，从而提高特殊功能菌株的筛选效率。早在1995年的专利中，Finkelstein等[14]就曾建议，通过在固体培养基中添加抗高胆固醇药物（例如：洛伐他汀）、抗高血脂药物、乙酰辅酶A合成抑制剂、类胡萝卜素合成抑制剂、类异戊二烯合成抑制剂、自由基产生剂（例如杜醌）以及β-紫罗兰酮等，皆能起到定向筛选β-胡萝卜素高产菌株的作用。

根据文献报道[33-35]，洛伐他汀是筛选β-胡萝卜素高产菌株常用的抑制剂。由于洛伐他汀（尤其是其水解后的酸性结构）是羟甲基戊二酰CoA（HMG-CoA）结构类似物，因此可以通过底物抑制效应而降低羟甲基戊二酰CoA还原酶（HMGR）的酶活力，从而降低胆固醇生物合成，甚至干扰脂肪代谢，以致影响细胞正常生理代谢。通过诱变处理，部分突变株HMGR的编码基因由于发生突变，从而可能解除HMG-CoA及其结构类似物对HMGR的抑制作用，因此能在含有洛伐他汀的培养基中得以存活。另外，突变株由于不再受HMG-CoA的抑制，因而β-胡萝卜素合成的代谢通量得到显著提高。国内顾秋亚[19]、刘海丽[12]等也曾将该技术进行应用，并取得良好的筛选效果。

在本实验室研究中发现，随着对三孢布拉氏霉菌进行不断的选育，突变株甚至能够在高浓度洛伐他汀（高达2 g/L）环境下正常生长。推究该现象可能系突变株的HMGR在长期的诱变筛选过程中，逐步降低甚至完全丧失对洛伐他汀的敏感性；甚至有可能借助耐药机制的产生，而使突变株对洛伐他汀产生耐药性。基于β-胡萝卜素合成过程中有多种酶参与其合成代谢，因此充分了解相关酶的表达调控及构效机制，针对不同酶开发并合理选择新型高效抑制剂进行组合运用，可以利用定向进化[36]以及核糖体工程[37]等技术强化β-胡萝卜素合成代谢通量，以取得良好的选育效果。

2 三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素工艺的优化

三孢布拉氏霉菌作为目前生产β-胡萝卜素的主要工业菌株，国外早在20世纪50年代就开始对该过程工艺进行系统的研究[38]。有关三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素的研究，按照反应器的类型分为：摇瓶、搅拌桨式反应器以及气升式反应器发酵；如按照发酵培养方式，主要以批次发酵和补料分批发酵为主。根据三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素工艺的特点，科研工作者对接种方式、培养基组分、发酵工艺参数和反应器进行了系统的研究和探索，并逐步开发出符合工业化生产要求的工艺，使得β-胡萝卜素的发酵生产水平以及过程经济性得到不断的提高。

2.1 三孢布拉氏霉菌正负菌接种方式的研究进展

无性孢子的形成和萌发、菌丝体的断裂和生长、以及接合孢子的形成和萌发是三孢布拉氏霉菌主要的细胞增殖方式[8]。基于三孢布拉氏霉菌的生理和代谢特点，通过将正负菌分别进行无性培养，并在发酵过程中进行混合配对，可以有效提高对发酵过程中正负菌比例的控制，从而实现β-胡萝卜素的高水平发酵需求。针对该菌株特殊的生理和代谢特点，早在20世纪60年代，国外科学家就已经开始对三孢布拉氏霉菌种子液制备及接种方式进行系统的研究，并不断对不同的研究目的发展出各具特色的工艺类型。

2.1.1 利用斜面培养物分别制备三孢布拉氏霉菌正负菌种子液

早期β-胡萝卜素发酵所需种子液，以接种正负菌株斜面培养物的方式进行制备。Ciegler等[38]通过将NRRL2456（正菌）和NRRL2457（负菌）斜面培养物接种于种子培养基，并分别按照5%的接种量实现两菌株的混合发酵。随后，Ciegler等[39]利用20 L发酵罐开展β-胡萝卜素发酵研究发现，发酵种子液制备方法及接种操作会对β-胡萝卜素发酵水平产生不同程度的影响。其中，将正负菌株种子液分别直接接种发酵的工艺，其β-胡萝卜素发酵水平明显优于正负菌种子液预混合孵育的发酵工艺。当正菌与负菌接种体积比为1∶1（总接种量为10%）时，β-胡萝卜素发酵水平最佳，但总接种量对β-胡萝卜素发酵水平无显著影响。

对于摇瓶发酵而言，由于正负菌种子液的制备过程中有时会出现菌丝体相互缠绕形成较大的菌团或者菌块，因此较小体积规模的发酵很难实现接种时的均匀定量控制。为解决该问题，Dandekar等[40]分别将三孢布拉氏霉菌正负菌的斜面培养物接种于含有10 g/L麦芽汁的种子培养基中，通过对培养得到的正负菌菌丝体分别进行均质分散，以此作为批量摇瓶发酵的种子液。通过该方法，Dandekar等证实环腺苷酸参与了三孢布拉氏霉菌三孢酸和β-胡萝卜素的合成、菌体生长、繁殖以及菌体形态发育等诸多生理代谢过程的调控，但种子液均质对β-胡萝卜素发酵的影响却并未见详尽的报道。

2.1.2 三孢布拉氏霉菌孢子接种分别制备正负菌种子液

与接种斜面培养物制备发酵所需种子液的方法相比较，孢子由于分散均匀且可以通过显微技术等方法进行快速定量，因此有利于菌种接种的定量控制。2006年Böhme等[41]发现，正菌孢子萌发时间迟缓于负菌孢子，但后期正菌菌丝体生长速度却明显快于负菌。基于该现象，该研究组对正负菌种子液的培养时间以及合适的接种菌龄进行了系统的研究。当孢子接种量约为1.7×103个/mL时，种龄为20 h的负菌种子液与种龄为24 h的正菌种子液适宜接种发酵。当正负菌种子液以1∶30的体积比进行配对发酵时，β-胡萝卜素发酵水平最佳，达到0.45 mg/L。潘鹏等[42]利用正负菌株孢子悬浮液进行种子液制备时也发现，正菌细胞量增长速率显著快于负菌，正负菌种子液适宜接种的种龄分别为12～15 h和25～30 h。通过接种量和接种比例的优化发现，正负菌种子液接种总量为20%，且体积比控制在2∶3时，β-胡萝卜素发酵水平最佳，达到12.2 mg/L。

2.1.3 三孢布拉氏霉菌正负菌孢子混合直接接种发酵

有关直接以正负菌株孢子混合接种发酵的方法，Kim等[43-44]于1997年曾对此进行了应用。该课题组以1×105个/mL孢子接种量，直接将正负菌株的孢子接种于50 mL发酵培养基中（250 mL摇瓶），并对司盘、吐温和曲拉通3 类表面活性剂进行了筛选和优化。研究发现，司盘-20对β-胡萝卜素以及三孢布拉氏霉菌合成中间代谢物三孢酸皆具有较好的促进作用，发酵水平可达2.3 g/L，比不含司盘-20的对照组提高2.7倍。随后，该课题组通过接种5×106个正菌孢子和1×107个负菌孢子，系统研究了H2O2对β-胡萝卜素发酵的影响。结果表明，发酵培养基中添加10 μmol/L的H2O2，可以使菌丝体中的β-胡萝卜素含量比对照组提高约46%[45]。由于孢子直接接种操作简单，兼之摇瓶发酵体积较小，因此该方法极大地提高了工作效率，适宜于对大量的实验考察因素进行快速的筛选判别。

综上所述，三孢布拉氏霉菌发酵种子液的扩大培养，作为实验室研究成果向工业化生产逐步放大中必须面对的技术环节，其研发历程呈现如下特点：种子液接种方式从简单的斜面培养物直接接种，逐步发展到精确定量接种孢子；而发酵接种控制则从简单的体积混合配比，逐步强化至根据菌龄和菌体浓度和菌体浓度进行接种量和接种比例的定量控制。

由于曾有报道三孢布拉氏霉菌负菌孢子无法进行大量的制备[46]，加之工业大规模发酵需要大量的种子液以满足大规模发酵制备的需求，因而定量接种孢子并对无性培养的正负菌种子液进行逐级放大的工艺，则是三孢布拉氏霉菌接种控制及种子液制备的主要方法。另外，由于其他接种和种子液制备方法具有操作简便等技术优势，因此通过对其进行不断的完善和改进，亦可使其在诸如菌种选育与发酵培养基筛选等特定研究工作中发挥独特的作用。

2.2 三孢布拉氏霉菌发酵产β-胡萝卜素培养基优化的研究进展

培养基种类和组成是实现β-胡萝卜素发酵的基本条件之一，其中碳源、氮源以及油脂是三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素用量最大，生产成本所占比重最高的3种培养基组分。通过对主要培养基组分进行筛选以及优化，是提高β-胡萝卜素发酵水平，并降低生产成本的常用手段。

2.2.1 发酵培养基碳源和氮源的筛选和优化

碳源和氮源是细胞生长过程中能量供应以及合成细胞物质的重要原料，其中碳源更是合成β-胡萝卜素的主要原料。早在20世纪50年代，Ciegler等[38]就曾以各类谷物及其加工副产品作为碳氮源进行β-胡萝卜素的发酵研究。近年来，Choudhari等[47]亦曾对各种常见的碳源进行过系统的比较，其中以60 g/L葡萄糖作为碳源时，β-胡萝卜发酵效果最佳。另据研究报道[24]，以玉米淀粉替代葡萄糖进行进行β-胡萝卜素发酵，可以取得更好的应用效果；但基于发酵成本的考虑，玉米粉可能具有较好的应用潜力。除此之外，也有研究者尝试使用一些廉价的碳源，如甜菜或甘蔗废糖蜜[48]、工业甘油[49]、以及制糖、奶酪和乳品制造行业的工业废水[50]等生产β-胡萝卜素。近年来，随着基于糖平台生物炼制过程的不断发展，从自然界寻找更为廉价的碳源已成为可能，这也为提高β-胡萝卜素发酵过程的经济性指标提供新的契机。

据研究报道[51-54]，黄豆粉是目前β-胡萝卜素发酵最为常用的氮源。近年来，张宁等[24]研究发现，豆粕和棉籽蛋白亦皆具有较好的应用效果，其中又以30 g/L棉籽蛋白对菌体和β-胡萝卜发酵促进效果最佳。虽然，Choudhari等[47]研究指出，在其考察的氮源中，1 g/L的酵母提取物对细胞生长以及β-胡萝卜发酵促进作用最佳，其次为大豆蛋白胨和牛肉蛋白胨，而相同条件下豆粕的影响几乎可以忽略不计。但由于酵母提取物营养成分丰富，因此经常被用作微生物生长因子的重要来源，但由于其价格较高，因此常以玉米浆作为其替代物。Goksungur等[55]的研究表明，50 g/L的玉米浆可以有效替代1.0 g/L酵母提取物应用于β-胡萝卜发酵。

由于三孢布拉霉菌高效发酵制备β-胡萝卜是基于菌体的大量繁殖以及β-胡萝卜大量累积的过程，因此合理的平衡培养基中的碳氮源组成，确保合理的生物量，可以避免碳源和氮源的无效消耗，提高培养基成分向β-胡萝卜的转化效率。另外，鉴于三孢布拉霉菌发酵制备β-胡萝卜的培养基组分通常为各类谷物，其中包括了大量的植物蛋白和多糖成分。为了快速的利用这些大分子化合物，三孢布拉霉菌除需要利用碳氮源合成细胞物质之外，还要合成大量的水解酶，以实现培养基成分的充分利用。合理的选择培养基组分，并对其进行适当的预处理，将可以有效的提高培养基中大分子物质的利用速率，同时亦可提高原料的转化效率。

2.2.2 发酵培养基植物油脂成分的筛选和优化

三孢布拉氏霉菌发酵β-胡萝卜素的过程中，植物油的添加可以为细胞的合成代谢提供额外的大量能量和碳骨架，同时亦可作为前体物质用于β-胡萝卜素的合成代谢。而葡萄糖作碳源，尽管也可以转化为短链脂肪酸参与β-胡萝卜素的生物合成，但大部分通过三羧酸循环而参与能量代谢。

近几年，张宁[24]、顾秋亚[56]、Choudhari[57]和Papaioannou[58]等曾分别系统比较了棉籽油、大豆油、亚油酸、葵花籽油、橄榄油、棕榈油、玉米油、葵花油和花生油对三孢布拉氏霉菌生长以及β-胡萝卜素合成的影响。在所考察各类植物油中，最常用的为棉籽油和大豆油，其中又以棉籽油对β-胡萝卜素发酵的促进效果最佳[56]。张宁[24]、Papaioannou[58]等研究表明，在其考察的植物油脂中，大豆油和橄榄油对菌体生长的促进作用最佳，而棉籽油以及含有较高亚麻酸的葵花籽油最有利于β-胡萝卜素的发酵。然而Choudhar等[57]却研究发现，30%葵花籽油和橄榄油虽然可以促进菌体的生长，但对β-胡萝卜素合成却有抑制作用；而棕榈油、橄榄油和玉米油虽然能获得良好的生物量，然而β-胡萝卜素发酵得率较低。在其所考察植物油脂中，以大豆油对β-胡萝卜素促进效果最佳。廖春丽等[59]利用响应面法优化发酵培养基时曾发现，在其考察的浓度范围内，柠檬酸、黄豆粉氮源和棉籽油相互间存在交互作用，并最终影响菌株的β-胡萝卜素发酵水平。不同课题组研究之间的巨大差异，可能与发酵所用的菌株或者培养基组成及其含量的差异有关。

虽然植物油的存在提高了真菌的生物量和类胡萝卜素的含量，但是培养基中植物油浓度偏高，亦会增加发酵液的黏稠度，从而影响摇瓶内的溶氧水平和菌体对底物的吸收利用[39]。另据研究报道[56]，油脂有可能通过将细胞中的β-胡萝卜素溶解，从而部分解除产物抑制，提高β-胡萝卜素的产量。

2.2.3 发酵促进剂对β-胡萝卜素生物合成的影响

在三孢布拉氏霉发酵过程中，当发酵培养基和发酵工艺条件已确定，加入一些发酵促进剂可以影响β-胡萝卜素生物合成途径中的关键酶活性，通过对代谢途径的调控，从而有效提高β-胡萝卜素的产量；表面活性剂的加入有利于菌体对培养基中植物油的利用；抗氧化剂的存在则可以避免已经生成的β-胡萝卜素被氧化。

2.2.3.1 类胡萝卜素的前体及结构类似物

类胡萝卜素的前体及结构类似物，如β-紫罗酮[38]及其替代原料如苎烯、柠檬油、芳香族化合物[60]。β-紫罗酮可激活生物合成途径中的甲羟戊酸激酶，该酶是胡萝卜素生物合成途径中主要的限速酶。通过在发酵过程中对β-紫罗酮的补加，能有效地提高β-胡萝卜素的产量[61-62]。刘月英等[63]在研究红酵母COS-5产胡萝卜素工艺时发现，通过添加盐酸硫胺素、橘子皮汁（含紫罗酮）、蕃茄汁（含八氢蕃茄红素和四氢蕃茄红素等β-胡萝卜素和其他类胡萝卜素的前体），均对该菌生物合成β-胡萝卜素有促进作用。顾秋亚等[56]研究了不同代谢促进剂对三孢布拉氏霉菌菌体生长和产物代谢的影响，其中，β-紫罗酮效果最佳，但由于其对早期的菌体生长具有毒性，故最佳补加时间为菌体生长进入稳定期后。

另外，一些化学添加剂能够影响很多微生物类胡萝卜素的产生。Tang Qiong等[64]研究了麦角甾醇合成抑制剂-酮康唑对三孢布拉氏霉hmgR基因和carRA基因转录的影响。结果显示，酮康唑触发了hmgR基因的转录，从而提高了β-胡萝卜素和辅酶Q10的含量。研究发现[65]基因carB与carRA是β-胡萝卜素的生物合成途径的关键基因，一定浓度的花生四烯酸[53]能使hmgR、carRA、carB基因转录平提高，并使β-胡萝卜素产量提高。

2.2.3.2 表面活性剂类发酵促进剂

由于发酵培养基中添加了大量的植物油，为了更好地利用植物油，可以对其添加表面活性剂，利用表面活性剂的两性改变微生物细胞膜的通透性和细胞表面的极性，使菌丝体分散比较均匀，从而进一步改变菌丝体的生理学性质和发酵液的流变性，刺激菌体生长与呼吸；同时，表面活性剂的乳化作用可以提高菌体的脂肪酶活性，促进菌体对植物油的分解和利用，最终提高β-胡萝卜素的产量[52]。

研究发现，在三孢布拉氏霉菌发酵培养基中加入一定浓度的Span-20[43-44]，OP乳化剂或吐温[52]均能有效的提高β-胡萝卜素产量。大豆卵磷脂是一种两性表面活性剂，研究发现[62,66]，向发酵培养基中添加大豆卵磷脂可以提高β-胡萝卜素的产量，并有效降低γ-胡萝卜素的产量，使目标产物更趋集中。

2.2.3.3 三羧酸循环中间产物类发酵促进剂

三羧酸循环中间产物在有氧代谢中发挥着重要作用，形成微生物类胡萝卜素的碳架。在培养基中添加一定量的柠檬酸和苹果酸，能够刺激类胡萝卜素的产生[67]。王常玲等[66]研究发现，发酵初期加入柠檬酸可以促进菌体的初级代谢，增强菌体的呼吸作用，使三孢布拉氏霉菌的生物量增加很快，从而为大量生产β-胡萝卜素提供基础。

2.2.3.4 抗氧化剂类发酵促进剂

β-胡萝卜素为类萜化合物，其结构含有许多双键，因此对氧很敏感，可以考虑在发酵后期向发酵液中添加抗氧化剂保护已生成的β-胡萝卜素。刘海丽等[52]研究发现，当添加的抗氧化剂乙氧喹为最佳浓度时，β-胡萝卜素产量增幅达70%。Nanou等[68]研究发现，三孢布拉氏霉菌发酵产类胡萝卜素，加入20 mmol/L的抗氧化剂丁化羟基甲苯时，得到的类胡萝卜素为125 mg/g干菌体。

综上所述，培养基组分筛选优化的相关研究，由于考察对象多、实验工作量大，采用可靠的数学模型对实验方案及结果进行统计分析，可以大大提高工作效率。尤其是有些培养基组分，很难用传统的碳源、氮源以及富含生长因子的组分进行清晰的界定，更不宜用简单的浓度均一考察或者碳氮含量归一处理进行组分的筛选。令人鼓舞的是，在近年来的研究工作中，除单因素考察法之外[47]，部分因子设计[69]、中心复合设计[70]、中心复合设计与均一精密[47]、遗传算法[71]以及响应面分析[47,70]等数学工具的大量应用，不仅方便了对发酵培养基多组分的全局优化及组分间交互作用的分析，而且有效促进了培养基组分优化等研究工作的高效开展。

2.3 三孢布拉氏霉菌发酵产β-胡萝卜素过程工艺参数的优化

2.3.1 温度对发酵产β-胡萝卜素影响的研究

温度可以通过影响各种酶反应的速率，从而改变菌体内各代谢途径的通量，并以此最终影响产物的合成速率甚至微生物的代谢方向。低温时微生物从环境中摄取营养的速率下降，同时代谢活动减弱，如蛋白合成速率也下降，生物膜功能被干扰；而类胡萝卜素量的增加和脂类的不饱和化都是对低温时生物膜功能减弱的补偿[67]。有研究表明，在28～30℃发酵将会增加β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素的含量，而产生番茄红素的最佳温度为25℃[47,72]。

2.3.2 发酵液pH值对发酵产β-胡萝卜素影响的研究

pH值的变化与培养基的组分尤其是碳氮比有很大的关系。在三孢布拉氏霉摇瓶发酵过程中，随着细胞对葡萄糖的快速吸收利用，二氧化碳的释放和有机酸的生成，导致发酵液的pH值很快下降到较酸的水平，随后缓慢上升，到发酵终止时pH值达到最高，可能是由于细胞的死亡、溶解导致胺代谢产物的释放造成的[73]。Mantzouridou等[70]研究了在基础培养基中不同初始pH值（6.0～11.0）对细胞生物量和β-胡萝卜素产量的影响，在pH值为7.0时获得的β-胡萝卜素（170.0 mg/L）为最高。Choudhari等[47]研究了初始pH 4.0～10.0的培养基对β-胡萝卜素的产量影响，在pH 6～7获得较高的产量为（99±1）mg/L。Kim等[74]则发现，利用碱性培养基（培养基灭菌前的初始pH值为10.0）可以得到较高的β-胡萝卜素产量。由于未对灭菌前后的培养基组分以及pH值变化进行分析，因此较难以推断高pH值对β-胡萝卜素合成的促进作用机理。通常情况下，糖分在高温及高pH值条件下其稳定性较差，但高pH值和高温环境可能有利于培养基中蛋白成分的水解，从而有利于菌体的生长利用。因此，如果能够通过严格的实验设计（例如接种前调节发酵培养基的pH值）以及发酵过程中的pH值和组分分析监控，将有助于得到更为确切可靠的研究结论。

2.3.3 溶解氧对发酵产β-胡萝卜素影响的研究

在摇瓶培养时，摇床转速固定的前提下，装液量的变化决定着培养基中溶解氧浓度的高低，从而影响细胞对氧的需求，而发酵罐中则可以通过提高搅拌转速和通氧量来改善。Nanou等[75]发现，在250 mL锥形瓶中放入25 mL培养基（气液相体积比为9.0）时，可使类胡萝卜素的产量达到最大115 mg/g干生物量；但是继续提高溶解氧水平至15.7（即气液相体积比为15.7）时，有可能极高浓度的活性氧会引起三孢布拉氏霉的氧化应激反应，从而导致类胡萝卜素的含量下降。另有研究结果表明[76]，发酵液中的菌丝球在较高的溶氧环境下会解体形成分散的菌丝体，从而有利于营养物质和氧气的传递和利用，以此提高β-胡萝卜素的发酵水平。

除增加氧气的供应之外，添加氧载体也可提高同一反应系统的传氧系数。有研究表明，通过在发酵过程中加入携带大量氧气的乳化植物油，可以有效的提高β-胡萝卜素的发酵水平[77]。另有研究也系统考察了HO[45,78]、22液体石蜡[54]、正己烷和正十二烷[79]作为氧载体对β-胡萝卜素合成的影响，发现以上氧载体在一定浓度下可刺激微生物的β-胡萝卜素形成，高于此浓度，其毒性可导致β-胡萝卜素产量大大下降。

2.3.4 发酵产β-胡萝卜素培养方式的研究进展

对三孢布拉氏霉菌进行补料分批培养，可达到很高的生物量和β-胡萝卜素[80]，向发酵罐中通入纯氧并间歇性补加葡萄糖，既可以控制罐中由于表面活性剂等产生的泡沫，合适的溶解氧浓度也利于菌体生长和产物生成[73]。Nanou等[81]研究了在鼓泡床反应器中通过提高通气量诱导氧化压力，并研究了三孢布拉氏霉菌的形态改变情况，在通气量为4 vvm时，得到类胡萝卜素最高产量（55.0±2.5）mg/g干菌体，其中β-胡萝卜素的含量占91.68%。Mantzouridou等[82]考察了在搅拌反应釜中，通气量和搅拌速度对三孢布拉氏霉菌的形态及发酵产β-胡萝卜素的影响。在通气量为1.5 vvm、叶轮转速150 r/min条件下，β-胡萝卜素最高质量浓度达到1.5 kg/m3。Perez等[62]通过在发酵中期多次流加含10% β-紫罗酮的植物油，使β-胡萝卜素的产量达到8.7 g/L。许新德等[77]在三孢布拉氏霉菌发酵培养24 h后分批补加植物油，不仅保持了培养基黏度的均一性，还提高了植物油利用率，进而促进了三孢布拉氏霉的产能。

3 反应器工程技术在三孢布拉氏霉菌发酵产β--胡萝卜素中的应用

三孢布拉氏霉菌属于高度好氧的微生物，在其发酵培养的过程中，由于培养基黏度大，固形物（包括大量生成的菌体）含量高，生长过程中菌丝体容易纠结成团，导致发酵系统的溶氧速率较低。在发酵罐中如若加大搅拌力度，则会造成菌丝体的损伤，使生产能力下降[73]。

在早期的研究中，童海宝等[83]曾通过使用上、中层为宽叶推进式，下层为涡轮式的组合式搅拌桨叶，在提高了发酵液的传质性能和气液接触效率的同时，降低对菌丝体的剪切损伤，发酵水平达到2.0 g/L以上。另外，谭新国等[84]也系统比较了不同桨型的搅拌桨对β-胡萝卜素产量的影响。在最佳搅拌形式下，β-胡萝卜素发酵水平达到（1.547±0.305）g/L，比反应器优化前的发酵水平提高了5.05倍。

与搅拌型反应器相比，升式反应器可以利用通入的空气引起气液环流，实现发酵液的全混和搅拌，提高传质系数。在满足生物量对高溶氧要求的同时，减小了剪切应力对细胞的损伤，因此广泛应用于植物和丝状真菌的发酵培养[85-87]。姜文侯等[88]通过应用3 000 L气升式反应器培养三孢布拉氏霉菌，实现了β-胡萝卜素的发酵制备，在27℃发酵114 h，β-胡萝卜素产量达到1.328 g/L。此外，Varzakakou等[87]通过利用1.4 L玻璃气升式反应器，对β-胡萝卜素发酵过程中的三孢布拉氏霉菌自溶机理进行了探讨，对发酵过程中胞内的水解酶酶活力分析发现，蛋白酶以及几丁质酶直接介导了该过程。

对于三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素过程而言，由于发酵液生物量大，加之该菌种典型的低等丝状真菌，且β-胡萝卜素为胞内产物，因此对于发酵过程中的物质、能量和动量传递提出了更高的要求。如能在反应器尺度上针对该发酵过程进行针对系统的研究，将可以有效的挖掘菌株的生产潜能、提高过程的经济性指标。因此，新型反应器的开发和应用，将不失为促进 该领域取得突破性进展的重要研究方向。

4 结 语

在过去的半个多世纪里，三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素的研究一直随着生物工程和化工过程等相关学科的发展而不断深入。其中高通量菌种选育技术的开发和代谢工程研究的不断深入，将是获取高效细胞工厂的重要研究方向。对三孢布拉氏霉菌生理和代谢等基础研究的开展，不仅能够揭示三孢酸类物质生成及对β-胡萝卜素合成的调控机理，而且有助于创造全新的细胞，以实现单一菌株的发酵过程。如能利用代谢工程等手段，使纤维素酶等外源基因通过三孢布拉氏霉菌进行高效的分泌表达，更可能实现对木质纤维素等廉价碳源的直接利用。此外，通过对β-胡萝卜素发酵过程工艺的优化和强化控制，也为细胞工厂的有序运行提供重要的物流保障。通过合理的实验设计，并对各类常用的培养基组分进行科学系统的评价，不仅可以获得合理的培养基组分，而且通过经济的预处理方式以及补料流加策略的优化，亦可以强化对发酵过程菌株生长及代谢的过程控制，提高β-胡萝卜素发酵的效率。基于反应器尺度的生物发酵过程研究，是利用工程手段有效解决生物过程问题的重要手段。通过新型反应器的设计和研发，不仅可以为三孢布拉霉菌的生长以及β-胡萝卜素的合成提供适宜的外在环境，更可能通过质量和能量传递的改善，而使整个过程更为经济。

随着人们对生活品质的要求越来越高，以及对绿色天然产品的倡导，天然β-胡萝卜素的市场需求将会越来越大。三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素作为生物化工领域一个典型的混合菌发酵过程，虽然有其本质的缺陷，但也有其独特的过程优势。相信在相关科研工作者的努力之下，该研究方向会不断取得突破进展，进而建立起全新的发酵模式，并在其他高附加值产品的研发上绽放出新的生机和活力。

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