咖啡中功能性成分分离检测技术及安全性评价

杨剀舟，翟晓娜，杜秉健，冷小京*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 10008 3）

咖啡中功能性成分分离检测技术及安全性评价

杨剀舟，翟晓娜，杜秉健，冷小京*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 10008 3）

咖啡以其独特的风味口感以及生理活性成为世界范围内最重要的食品类商品之一。咖啡的生理活性主要来自于咖啡中的咖啡因、绿原酸以及类黑精等功能性 成分，这些成分具有醒脑提神、抗忧郁、抗氧化、抗菌以及预防癌症等方面的生物活性。因此，咖啡中功能性成分的分离提取、分析检测以及其安全性评价已经成为目前研究的热点。本文对咖啡中功能性成分咖啡因、绿原酸和类黑精的分离检测技术及其安全性评价研究进展进行综述，为咖啡中功能性成分的分离分析以及科学使用提供前沿的科学参考。

咖啡；咖啡因；绿原酸；类黑精；提取；检测分析；安全评价

咖啡作为世界三大饮料之一，已经被消费饮用了1 000多年，迄今为止全球消费咖啡超过4 000亿杯[1]。咖啡是茜草科植物Coffea L.的种子，大概有70多个品种，目前全球主要种植的品种是Coffea arabica和Coffea canephora（robusta）。巴西是世界上最大的咖啡豆种植国家[2]。咖啡中含有丰富的功能性成分，其中Arabica咖啡和Robusta咖啡生豆中酚酸类化合物绿原酸含量分别为6.7%～9.2%和7.1%～12.1%；咖啡因含量分别为0.8%～1.4%和1.7%～4.0%[2]；类黑精只存在于烘焙后的咖啡豆中，含量为16.0%～17.0%[3]。咖啡中的功能性成分除了赋予咖啡独特的风味口感外，还具有醒脑提神[4]、抗菌抗炎[5]、抗氧化[6]、抗癌[7]、治疗机体代谢综合征[8]和抑制体质量[9]等生物活性。本文通过对目前国内外最前沿的咖啡功能性成分分离检测技术和安全性评价研究进行综述，为咖啡功能性成分的检测分析和合理使用提供参考。

1 咖啡因、绿原酸和类黑精简介

1.1 咖啡因

图1 咖啡因化学结构式Fig.1 Chemical structure of caffeine

咖啡因又称为1,3,7-三甲基黄嘌呤，分子结构见图1，是一种广泛存在于烘焙的咖啡豆、茶叶、可可豆以及可乐果等植物中的生物碱类物质。咖啡因在咖啡中的含量大约在0.8%～4.0%之间，咖啡因结构十分稳定，烘焙前后含量基本不变[2]。咖啡因对诸多身体生理功能有益，比如能够抗忧 郁、控制体质量、预防癌症等，其中最主要在于其对中枢神经系统的影响，比如具有醒脑提神以及止疼等作用。

1.2 绿原酸

图2 5-咖啡酰奎宁酸化学结构式Fig.2 Chemical structure of 5-CQA

绿原酸（caffeoylquinic acid，CQA）主要是由咖啡酸、阿魏酸以及香豆酸等肉桂酸和奎宁酸酯化所形成的酚酸类化合物。常见的绿原酸单体主要有5-咖啡酰奎宁酸（5-CQA）（分子结构见图2）、二咖啡酰奎宁酸（diCQA）以及阿魏酸酰奎宁酸（5-FQA），其中5-咖啡酰奎宁酸的含量最高，大约占到咖啡中总绿原酸含量的72%[11]。绿原酸在咖啡生豆中的含量很高，含量大约在6.7%～12%之间；而烘焙后咖啡豆中的绿原酸含量为咖啡豆干质量的2.7%～3.1%[12]。这是由于大部分的绿原酸会发生降解，生成绿原酸内酯物[13]以及参与美拉德反应高级产物类黑精的合成过程[14]。绿原酸是咖啡中最主要的酚酸类化合物，具有良好的抗氧化、抗菌抗炎、清除自由基等生理功能。

1.3 类黑精

类黑精（Melanoidins）是食品中的羰基和氨基化合物发生美拉德反应所形成的棕褐色、大分子质量的聚合终产物。咖啡中的类黑精主要形成于咖啡烘焙过程中，烘焙后的咖啡豆中类黑精含量在16.0%～17.0%之间；在冲煮咖啡中占干物质总质量的25%[15]。类黑精主要包括高分子质量的类黑精和低分子质量的类黑精，其中高分子质量类黑精含量在59%左右，分子质量在12～14 kD之间。研究发现延长烘焙时间会显著的增加高分子质量类黑精的含量，并且相比较于低分子质量类黑精，高分子质量类黑精具有更深的棕褐色[3]。类黑精的形成过程极其复杂，目前主要有3个相关的合成理论：理论1是类黑精是由低分子质量美拉德反应中间体比如呋喃类、吡咯类、吡咯并吡咯类以及它们的衍生物在反应最后阶段相互聚合所形成，如图3所示[16]；理论2是类黑精是由蛋白结合生成吡咯啉酮赖氨酸还原酮聚合物，分子中含有赖氨酸的侧链，如图4所示[17]；理论3是类黑精的分子骨架主要是由糖分解代谢产物分支与氨基化合物比如氨基酸聚合而成，如图5所示[18]。咖啡类黑精作为咖啡中还原糖和蛋白质或氨基酸残基美拉德反应的产物，良好地继承了功能性糖分子和蛋白质的生理功能，具有清除机体自由基、抗氧化、抗菌、防龋齿和改善肠道微环境等诸多有益的生理功能。

图3 类黑精合成理论1中间体结构Fig.3 Chemical structures of intermediates during melanoidins synthesis according to Theory 1

图4 类黑精合成理论2中分子结构Fig.4 Chemical structure of melanoidin synthesized according to Theory 2

图5 类黑精合成理论3中分子结构Fig.5 C hemical structure of melanoidin synthesized according to Theory 3

2 咖啡因、绿原酸和类黑精的提取分离技术

目前国内外分离提取咖啡因、绿原酸以及类黑精的方法大致有溶剂萃取法、超临界流体萃取法、吸附和解吸法等。

2.1 溶剂萃取法

溶剂萃取法是利用咖啡因、绿原酸和类黑精易溶于水或有机溶剂的原理提取咖啡因，主要包括热水提取法、醇提法（甲醇和乙醇等）和有机溶剂提取法（三氯甲烷、二氯甲烷等）。虽然近来也有通过结合微波和超声波等物理场的方法来提高功能成分的提取率，但溶剂萃取法仍是目前咖啡中功能成分的主要提取技术。由于提取物质纯度不高，溶剂法一般应用于咖啡功能成分的粗提取。徐凤英[19]分别采用水提法、醇提法和有机溶剂提取法对茶叶中的咖啡因进行提取，并对3种提取工艺进行比较。研究发现醇提法的咖啡因提取率（g咖啡因/g原料）为最高的0.67%，其次为水提法的0.58%，有机溶剂提取法提取率为0.50%。然而，醇提法效率较低，耗时为水提法的2倍。李婧等[20]采用微波辅助萃取技术高选择性脱除茶叶中咖啡因，以沸水为溶剂，在固液比1∶50（m/V），微波功率160 W，微波时间6 min的条件下，咖啡因脱除率（g脱除咖啡因/g总咖啡因）高达80.56%。Bi等[21]在超声波处理下采用不同溶剂对咖啡豆残渣脱除咖啡因的效果进行了研究得出最佳的咖啡因提取工艺为：超声萃取，水和乙醇体积比50∶50（V/V），提取温度80 ℃，提取时间60 min，固液比1∶20（m/V），咖啡因提取率为0.33%。Upadhyay等[22]在微波处理下采用水相和溶剂相（甲醇和乙醇）对Robusta咖啡生豆中的绿原酸、咖啡因和多酚类物质进行提取研究发现，提取的最佳条件是微波功率800 W，提取温度50 ℃，提取时间5 min，提取溶剂为水。在最佳条件下绿原酸和咖啡因的最大提取率分别为8.40%和7.25%，结果明显高于相同条件下采用甲醇或乙醇为溶剂的热回流萃取所得到的绿原酸和咖啡因的提取率。相比较于采用水作为溶剂，在醇溶剂微波条件下，绿原酸的提取率只有5.60%，但是其纯度比以水作为溶剂得到的绿原酸纯度高15%；咖啡因提取率为3.44%，两者纯度差别不大。微波法相比较于传统的热加热回流法，具有效率高、萃取时间短、节约试剂以及产物得率高等诸多优点。

2.2 超临界流体萃取法

超临界流体萃取技术是一种新出现的应用于食品和药品的清洁的提取技术。这项技术主要依赖于流体在超临界状态下的高渗透特性以及被萃取物质在超临界流体中的溶解度，常用的超临界流体主要是非极性的CO2。目前国内外采用超临界流体萃取技术提取咖啡因和绿原酸的研究报道相对较多，研究的热点主要集中在采用混合溶剂比如水和乙醇等提高咖啡因的提取效果上。Tello等[23]采用超临界状态下的CO2流体对咖啡壳废料进行咖啡因提取研究，考察了超临界压力、温度、时间以及流速对提取效果的影响。研究发现更高的流速和更长的萃取时间可以获得更快的萃取速度；更高的萃取压力和温度可以获得更高的咖啡因溶解度。在萃取温度为373 K，萃取压力为30 MPa，CO2和咖啡壳质量比为197∶1的条件下，咖啡因的萃取率最大，为84%。经后续水洗处理后，咖啡因的纯度高达94%。Azevedo等[24]采用单纯的CO2和CO2与乙醇或异丙醇的混合溶剂分别在超临界条件下对咖啡生豆中的咖啡因、绿原酸以及咖啡油进行提取，研究发现采用单纯CO2（15.2 MPa，50 ℃或60 ℃）、CO2和乙醇混合溶剂（24.8 MPa，50 ℃或60 ℃）以及CO2和异丙醇混合溶剂（35.2 MPa，50 ℃或60 ℃）的咖啡因得率（g咖啡因/g溶剂）分别为1.7%、17%和2%，得率较低的原因可能来自与咖啡豆中的咖啡因 和绿原酸聚合以及咖啡因和绿原酸之间的氢键被破坏，同时混合溶剂浓度较低也对咖啡因的得率有很大影响。

2.3 吸附和洗脱与分配色谱分离法

吸附与洗脱提取法是利用吸附剂与咖啡中功能性成分具有特有的吸附特性而与其它成分分离，然后再用洗脱剂将功能性成分洗脱下来的一种方法。Rodrigues等[25]采用以C18柱为吸附材料的固相萃取技术对20种Arabica咖啡和Robusta咖啡饮料中的咖啡因和有机酸进行分离，样品采用甲醇和水作为洗脱剂，洗脱液通过高效液相色谱-紫外检测器对咖啡因和有机酸进行定量。研究发现固相微萃取技术对于咖啡因的回收率高达98.1%。Jin等[26]在固相萃取过程中分别采用分子印迹聚合物（molecular imprinted polymer，MIP）和常规的C18硅胶柱作为吸附材料对绿茶中的咖啡因和一些儿茶素成分进行分离，并采用HPLC对咖啡因和儿茶素进行定量。在分子印迹聚合物制备中，采用咖啡因作为模版，甲基丙烯酸作为单体，儿茶素作为交联剂，偶氮二异丁腈作为引发剂。研究发现以MIP作为吸附材料的咖啡因回收率是以C18硅胶柱作为吸附材料的回收率的2～4倍，并且咖啡因的纯度接近100%，MIP较常规的C18柱对目标咖啡因分子具有更高的亲和力和回收率。Romero-González等[27]采用逆流离心分配色谱法对咖啡中3种常见的绿原酸（5-CQA、5-FQA、3,5-diCQA）进行分离提取，在乙酸乙酯-正己烷为固定相，不同离子梯度的氯化锂和硫酸铵-硝酸钾在两端分别作流动相的条件下成功实现了分离，同时催化5-CQA产生的异构体也得到了很好地分离。Gniechwitz等[28]采用以交联葡聚糖和辛基琼脂糖凝胶为固定相和以氯化钠溶液为流动相的疏水作用色谱对冲泡咖啡高分子质量提取物中的类黑精成分进行分离提纯，通过紫外可见光分光光度计在405 nm波长对类黑精含量进行检测，发现类黑精水溶液质量浓度低至40 μg/mL，并且分子质量范围在3～22 kD。

2.4 透析、超滤以及分子排阻色谱法

目前，对于咖啡中类黑精的分离提取方法主要有透析法、超滤法以及分子排阻色谱法。Bekedam等[29]采用0.7 m2的分子质量为3 kD的中空纤维过滤器和0.7 m2的分子质量为3 kD的透析膜对咖啡中的高分子质量类黑精和低分子质量类黑精进行分离提取，并通过紫外分光光度计在405 nm测定类黑精含量，结果发现高分子质量类黑精的含量为16%，而低分子质量的类黑精含量为82%，高分子质量类黑精含量为脱脂咖啡豆干重量的3.6%。Borrelli等[15]采用以交联葡聚糖为色谱柱的凝胶过滤层析成功地对咖啡生豆和烘焙咖啡提取物中的类黑精进行分离提纯，通过紫外分光光度计在405 nm波长对类黑精的组成进行检测，并结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对各部分组分进行鉴定分析。研究发现类黑精分子质量 在2～4 kD之间，低于预期值，这可能是由于具有高分子质量的 非离子化聚合物存在于样品中但未被检测到，也有可能由于聚合现象导致对分子质量的过高估计。

2.5 升华法

升华法[30]是利用咖啡因在温度≥100 ℃时具有升华的性质，从而将其从咖啡浸提物中分离出来。目前常用的制备流程为：升华、去杂、重结晶、含水咖啡因；或浸提、去杂、升华、无水咖啡因。升华法一般配合上述方法对提取的粗咖啡因进行精制。

3 咖啡因、绿原酸和类黑精的定量检测技术

国内外对于咖啡中功能性成分的分析检测技术进行了大量并且卓有成效的研究，目前采用的检测技术主要有高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）、气相-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）、薄层色谱-质谱联用（thin layer chromatography infrared spectrometry-mass spectrometry, TLC-MS）、紫外-可见光分光光度法（ultraviolet visible spectroscopy, UV-Vis）、实时离子化高分辨率质谱（direct analysis in real time, DART）、傅里叶变换衰减全反射红外光谱（attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR-ATR）、拉曼光谱、电化学分析（伏安感应器）、以及胶束毛细管电动 色谱（micellar electrokinetic chromatography）等。

3.1 色谱法

目前对于咖啡因、绿原酸和类黑精含量的色谱检测分析方法主要有液相色谱法、气相色谱法和紫外可见光色谱分析法。液相色谱法（或结合质谱）是咖啡因和绿原酸最主要的检测方法，而类黑精最主要的检测方法是紫外色谱法。Minamisawa等[31]采用自制的溶胶凝胶柱和十八烷基硅烷柱，以二极管阵列和紫外可见光检测器（210 nm）作为检测器的高效液相色谱对烘焙后的咖啡豆中的咖啡因和有机酸含量进行检测，结果发现咖啡因和有机酸在溶胶凝胶柱中能够得到同步分离，咖啡因在保留时间为4～6 min时可以彻底地分离，并且分辨率在单柱和联柱中高达2.76和3.22。Shrivas等[32]采用溶剂微萃取法（solvent microextraction，SME）从咖啡、可乐以及茶饮料中对咖啡因进行提取预浓缩，然后用气质联技术用对咖啡因含量进行检测，研究发现在饮料中咖啡因的含量为74.8～389.6 μg/mL，相对标准偏差为2.3%～7.5%，SME/GC/MS可以成功应用于咖啡因的检测，并且具有方便、快捷、灵敏度高以及样品量小等诸多优点。Bispo等[33]以甲醇（乙醇）-水-乙酸作为流动相，流速为0.7 mL/min，C18柱作为色谱柱，采用反相高效液相色谱对咖啡饮料和尿液中的咖啡因等生物碱类进行同步检测分析，研究发现在上述条件下，咖啡因的检测限高达0.1 pg/mL，咖啡因在咖啡饮料和尿液中的含量范围分别为0.1 pg/mL～350 μg/mL和3.21～71.2 μg/mL。该方法可以实现对咖啡因类生物碱物质同步检测，并且避免了萃取和衍生步骤。Fujioka等[34]采用液相色谱对7个常规咖啡样品和5个脱咖啡因样品中的绿原酸和咖啡因含量进行检测分析，研究发现绿原酸主要由咖啡酰奎宁酸、阿魏酸酰奎宁酸和二咖啡因酰奎宁酸组成，绿原酸的总含量在常规咖啡样品和脱咖啡因样品中的含量分别为5.26～17.1 mg/g和2.10～16.1 mg/g。其中5-咖啡酰奎宁酸的含量最高，在所有咖啡样品中的含量为2.13～7.06mg/g，分别占常规咖啡样品和脱咖啡因样品中绿原酸总含量的36%～42%和37%～39%；咖啡因在常规咖啡样品和脱咖啡因样品中的含量分别为10.9～16.5 mg/g和0.34～0.47 mg/g。Belay等[35]采用紫外可见光分光 光度计对咖啡豆中的咖啡因含量进行检测 分析，通过获得纯水以及二氯甲烷中纯咖啡因在272 nm和274.7 nm的十进制摩尔吸光系数和过度偶极矩，可以实现快速简便地对咖啡豆中的咖啡因含量进行定量，此外通过高斯拟合可以消除咖啡因色谱中的干扰因素。Bekedam等[29]采用紫外分光光度计分别在280、325、405 nm波长下对咖啡中高分子质量类黑精和低分子质量类黑精检测分析做了详细的研究，通过各个波长下的比消光系数（Kmix）和朗伯比尔定律对咖啡样品中各分子质量的类黑精的含量进行计算。该方法主要原理是在405 nm波长下，除了棕色的类黑精组分吸光外，其他的食品组分都不吸光，因此可以高效率地区别食品组分中的糖、蛋白和类黑精等组分。

Danhelova等[36]采用实时离子化高分辨率飞行时间质谱法（DART-TOFMS）对烘焙咖啡粉、速溶咖啡以及咖啡胶囊中的咖啡因含量进行快速检测分析研究，并以常规的HPLC-UV进行对比，评价该方法的检测效果。研究发现经过简单的咖啡因萃取过程后，DART-TOFMS法完全可以实现不同咖 啡样品的全自动实时定量分析，萃取物检测水平＞0.1 μg/mL，并且检测结果和常规的HPLC-UV方法具有很好的一致性，两者的检测结果相关性系数R2接近于1。Clifford等[37]采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）对Robusta咖啡生豆中含量较小的先前未报道的15种香豆酰奎 宁酸类绿原酸进行分析检测，研究发现香豆酰奎宁酸主要由（3,4-、3,5-、4,5-）香豆酰奎宁酸、（3,4-、3,5-、4,5-）咖啡酰香豆酰奎宁酸（香豆酰咖啡酰奎宁酸）和（3,4-、3,5-、4,5-）香豆酰阿魏酰奎宁酸等物质组成，结合先前研究报道最终在Robusta生豆中发现了45种绿原酸。同样的，Clifford[11]和Jaiswal[38]等也采用LC-MS对咖啡中的绿原酸异构体或由小分子酸组成的绿原酸进行了研究，并取得了理想的结果。

3.2 光谱法

Garrigues等[39]采用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）对烘焙咖啡样品中的咖啡因含量进行检测分析，咖啡样品首先采用0.25 mol/L氨水溶液进行润湿，然后用三氯甲烷溶剂对咖啡因进行萃取，之后在基线1 900～830 cm-1范围内采用1 659 cm-1傅里叶变换红外光谱测定吸光度。研究发现该方法可以显著降低萃取过程有机溶剂的使用。咖啡因含量检出限为3 mg/L，咖啡样品中的咖啡因3次检测的相对标准偏差s为0.4%，采用回收实验对其准确度进行研究发现，样品的回收率在94.4%～100.1%之间。Huck等[40]采用近红外光谱法对烘焙后的Arabica和Robusta咖啡豆中的咖啡因、可可碱和茶碱含量进行定量分析，并和常用的HPLC-MS（UV）检测方法进行对比，结果表明选择近红外光谱的校准方法为关键，而采用无孔的C18硅胶柱的HPLC正好可以提供快速的检测及校准。采用LC-UV对近红外光谱进行校准，通过分析83个液体咖啡萃取物可知，咖啡因含量的标准估计误差为0.34 g/100 g，标准误差为0.07 g/100 g，并且在浓度范围为0.10～4.13 g/100 g内的相关性系数为0.86；和液相色谱最低检出限为0.244～0.60 ng/100 g相比，近红外光谱的最低检出限为更低的0.05 g/100 g，因此具有快速分析以及高处理量的近红外光谱法也可以成为一个可行的咖啡因检测技术。Armenta等[41]采用固相傅里叶变换拉曼光谱对能量饮料样品中的咖啡因进行分析检测，并采用LC-UV对检测记过进行对比，研究发现拉曼光谱和常规的液相色谱检测结果具有很好的线性关系，并且两者的拟合方程回归系数R2高达0.997，表明拉曼光谱和液相色谱一样具有很高的精确度，同时固相条件改变可以实现对样品的一步清理和分析物预浓缩，也增加了拉曼光谱技术的选择性，避免多元矫正技术的使用。Shao等[42]采用近红外光谱对烟草叶片中的绿原酸含量进行检测，通过连续小波变换对近红外干扰背景进行处理，该方法成功地应用于偏最小二乘法模型对于绿原酸含量的模拟分析，相比较于Savitzyk-Golay和 其他方法具有更高的预测准确度。近来也有学者采用核磁共振（NMR）对来自于苹果汁中的绿原酸进行测定，该方法的准确度通过重复性和再现性实验研究表明两者的变动系数分别为5.7%和7.5%，说明该方法具有很高的准确性，其中样品中的绿原酸含量为586 mg/L[43]。

3.3 电化学 分析和分子印迹聚合物技术

Amare等[44]采用以聚合物改性的玻璃碳电极的循环伏安法和方波伏安法对咖啡中的咖啡因进行检测，采用4-氨基-3-萘酚磺酸聚合物对玻碳电极进行电聚合，研究发现改性后的电极对于咖啡中的咖啡因检测具有很高的灵敏度、选择性和稳定性，分析过程不受样品品质和结构类似物的影响；咖啡因浓度在6×10-8～4×10-5mol/L范围内，峰值电流随着咖啡因浓度的增加而增加，同时咖啡因的检出限为1.37×10-7mol/L；回收率在（93.75±2.32）%和（100.75±3.32）%之间，表明该方法可以应用于实际样品中的咖啡因的检测。在另外一篇研究中，Aklilu等[45]采用1,4-苯醌对碳糊电极进行修饰改性，然后通过循环伏安法和方波伏安法对咖啡因的含量进行检测，结果表明1,4-苯醌修饰的电极在重复检测过程中展现了可重复的界限清楚的峰电流值，同时随着咖啡因含量的升高出现峰电流值的降低；在咖啡因浓度在0～0.5 mmol/L和0.5 mmol/L两个区域内，峰电流值出现线性变化，检出限分别为0.3 μmol/L和0.5 μmol/L，这种方法可以成功应用于咖啡样品中咖啡因的检测分析。Alizadeh等[46]采用对咖啡因具有选择性的分子印记聚合物和非印记聚合物来制备碳糊电极，然后通过微分脉冲伏安法对饮料和茶样品中的咖啡因进行定量分析，研究发现分子印迹聚合物不仅可以对咖啡因实现选择性识别，并且可以对样品中的咖啡因实现预浓缩。制备的电极对于咖啡因的检测主要包括电极中样品萃取、电极清洗以及电化学检测3个步骤。分子印迹聚合物制备的电极相比较于非印记聚合物制备的电极具有更高的识别能力。咖啡因浓度在6×10-8～2.5×10-5mol/L范围内，检测器的峰电流值呈现出线性变化，传感器的咖啡因检出限为1.5×10-8mol/L。Zougagh等[47]采用基于分子印迹聚合物的在线支撑液膜压电检测器对咖啡和茶中的咖啡因含量进行检测，样品浆体直接进入位于注射阀回路的支持液膜上，然后咖啡因从样品中释放通过液膜进入一个酸性接收器隧道，最后采用分子印迹聚合物改性的石英晶体电极进行检测。研究发现底物质量浓度在10～1 000 ng/mL范围内，峰电流值出现线性变化，并且相对标准偏差在5%（50 ng/mL）。de Carvalho等[48]制备了一种模拟儿茶酚氧化酶活性位点的新型四环铜复合物仿生改性碳糊电极传感器，然后采用方波伏安法对咖啡样品中的绿原酸进行检测分析，研究发现绿原酸的含量在5.0×10-6～1.45×10-4mol/L的范围内出现线性变化关系，R2为0.998 5，检出限为8.0×10-7mol/L。制备的仿生传感器具有长时间使用稳定性和可再生性，检测结果相对标准偏差在10%范围内。绿原酸在咖啡样品中的回收率在93.2%～106.31%范围内，说明该方法精确度很高，此外该方法和毛细管电泳法测定的结果具有很好的一致性。

3.4 毛细管电动色谱法

Meinhart等[49]采用胶束毛细管电动色谱法对脱咖啡因咖啡中的咖啡因含量进行检测分析，通过中心旋转组合设计对缓冲液组成以及电压范围进行优化，回归弄醒、相关性系数以及主成分分析来确定最佳的实验条件。实验得到的最佳实验条件为：缓冲液组成为10 mmol/L的碳酸铵和50 mmol/L的十二烷基硫酸铵，电压15 kV，温度25 ℃，毛细管48 cm×50 μm，流体力学进样压力5 MPa，时间7 s，检测波长206 nm。在最佳条件下，线性范围为质量浓度在1～200 mg/L范围内，R2为0.999 7，咖啡因的量化检出限为2.88 mg/100 g。该方法成功的对45种脱咖啡因咖啡饮品的咖啡因含量进行检测。Tang等[50]采用毛细管电动色谱结合红外辐照法对传统中草药金银花中的绿原酸进行分离，然后通过毛细管阴极端的紫外检测器对绿原酸的含量进行检测，得到的最佳分离条件为：辐照时间30 min、分离电压16 kV，硼酸盐缓冲溶液浓度为50 mmol/L，pH值为8.7。在最佳条件下绿原酸的含量为1.86 mg/mL，相对标准偏差为3.5%，含量明显高于传统采用热溶剂萃取法。绿原酸的回收率为95.53%～106.62%，相对标准偏差为4.1%，表明该方法具有很高的精确度。

4 咖啡因、绿原酸和类黑精安全性评价

4.1 咖啡因安全性评价

4.1.1 咖啡因的代谢过程

咖啡因一旦被摄取，就会在胃肠道中被快速吸收并进入血液，然后进入肝脏中进行代谢。咖啡因在机体中的代谢99%在肝脏中进行，代谢形成的3种主要物质为3,7-二甲基黄嘌呤、1,7-二甲基黄嘌呤以及1,3-二甲基黄嘌呤。这些代谢产物在肝脏中继续去甲基和氧化分解成尿酸盐，其中大约有3%的上述代谢物以咖啡因的形式存在于尿液中[51]；血液中的咖啡因浓度在摄入后1～1.5 h达到最大；咖啡因在机体内的半衰期为5 h[52]。

4.1.2 咖啡因的功能性和 安全性

近年来，越来越多的研究发 现咖啡因在抗忧郁、控制体质量、预防癌症、治疗心血管疾病、治疗帕金森症、代谢综合征以及降低二型糖尿病风险等[53]方面具有重要的功能，但是也有研究表明咖啡因的摄入会增加孕妇流产、胎儿发育不良、干扰儿童神经发育和调节以及上瘾致死的潜在风险[51]。

Lucas[54]通过对50 739名平均年龄为63岁、无抑郁症状的美国女性老年人10 a间摄取咖啡因的量和患抑郁症风险的关系进行研究发现，增加咖啡因的摄入可以降低患抑郁症的风险。Nkondjock[7]通过研究咖啡摄取与患乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌和肾癌等癌症的风险的综述发现，咖啡中咖啡因与降低肝癌和肾癌具有一定联系；和绝经后乳腺癌及结肠癌关系不明显；而与前列腺癌、胰腺癌和子宫癌没有相关性；咖啡饮品可能降低肝癌患者的死亡率。Arendash等[55]利用咖啡因和含有咖啡因的咖啡饮料和转基因老鼠模型对阿茨海默症的治疗效果进行研究。研究发现对患有阿茨海默症的成年和年龄稍大的小鼠喂含有咖啡因的水对于恢复其记忆功能障碍具有很好的作用，同时可以显著降低被认为是阿茨海默症核心致病因的amyloid-β蛋白和其异常蛋白的含量。目前对于咖啡因摄取与心血管疾病关系的研究，主要集中在咖啡因摄取剂量与心脏相关风险因素（比如血压、血清胆固醇水平、心率）指标变化的关系，或者与心血管疾病发病率的关系。总的来讲，每天摄取≤400 mg的咖啡因（4杯咖啡/d）一般不会对心血管的健康产生风险；而每天摄取≥1 000 mg的咖啡因（10杯/d）就可能会引起冠心病甚至机体死亡[4]。

近年来，越来越多的研究发现咖啡对儿童和孕妇具有一定的副作用。CARE研究小组发现过多的摄入咖啡因会引起胎儿流产和损害胎儿生长，高风险的阈值目前还没有确定的指标，但是孕妇咖啡摄入量低于100 mg/d时，胎儿发育的风险会显著降低[56]。Lim等[57]研究发现咖啡因会干扰儿童的睡眠模式，从而影响生长发育，并且还会增加体质量和龋齿发病率。Hering-Hanit 等[58]研究对青少年摄入可乐与头疼关系时发现，青少年平均每周可乐摄入量为11 L，咖啡因每周摄入量高达1 414.5 mg，偏头痛发病率很高；当停止摄入咖啡因时，研究中的青少年头痛全部消失。因此合理的摄入咖啡因推荐儿童每日摄入咖啡因的含量不超过2.5 mg/kg[4]，孕妇每日摄入量不超过300 mg/d，即每日咖啡摄入量不超过2杯[59]。

4.2 绿原酸安全性评价

4.2.1 绿原酸的代谢过程

绿原酸在机体内的代谢主要发生在肠道和肝脏，其中肠道是绿原酸代谢的主要部位。研究表明肠道菌群是造成绿原酸水解的主要原因，绿原酸被水解为咖啡酸和奎宁酸，随后咖啡酸和奎宁酸进一步代谢。咖啡酸在肠道内被肠道菌群还原为二氢咖啡酸，二氢咖啡酸进一步脱羟基转变成为3-羟基苯丙酸；奎宁酸在肠道菌群作用下，母环脱羟基后转化为芳香环，成为莽草酸，进一步脱羟基后变为苯甲酸，苯甲酸与甘氨酸缩合形成马尿酸排泄到尿液。有一部分绿原酸、咖啡酸和奎宁酸透过肠道屏障进入肝脏，其中咖啡酸在肝脏中的代谢反应主要由甲基化反应、氧化反应、还原反应以及结合反应组成，形成一系列的代谢产物[60-62]。

4.2.2 绿原酸的功能性和安全性

大量的实验研究表明，绿原酸具有抗氧化、抗菌抗炎、清除自由基、抗高血压、抑制突变和抗癌以及保护心血管等生理功能。Sato等[63]对绿原酸和绿原酸的主要代谢产物咖啡酸在体内和体外的抗氧化特性进行研究。结果表明，在体外实验研究中，咖啡酸相比较绿原酸具有更高的抗氧化活性，同时被结肠腺癌细胞摄取的绿原酸含量也要明显低于咖啡酸；在体内实验中，采用肠缺血再灌注模型对两者的抗氧化性能进行评估，研究发现两者对于该模型具有同样的功效，原因为咖啡酸比绿原酸具有更好的抗氧化性能，而绿原酸在肠道内被水解成咖啡酸，推断可能咖啡酸在绿原酸对缺血再灌注损伤中的防护作用中起到了关键性的作用。Lou等[5]采用革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、大肠杆菌以及鼠伤寒沙门氏菌对绿原酸的抗菌性能进行研究，结果表明在最低抑制质量浓度（20～80 μg/mL）以上，绿原酸可以有效地抑制所有测试的细菌病原体。抑菌机理是绿原酸附着到细菌病原体的外膜，从而显著地增加了外膜和质膜渗透性，造成屏障功能的丧失，甚至导致核苷酸的轻微泄露，此外通过透射扫描电镜也观察到细胞质的渗出。Zhao等[64]综述了近年来绿原酸和高血压疾病之间关系，通过基础和临床研究发现绿原酸 具有一定的抗 压功能，从机理上分析是由于绿原酸的代谢物减弱了机体氧化压力，降低了活性氧水平，从而改善动脉血管中血管内皮功能以及一氧化氮的生物利用率，最终降低机体血压。虽然绿原酸具有上述诸多独特的生理学功能，但是也有学者研究表明作为绿原酸主要抗氧化活性的水解产物咖啡酸在高温（90℃）处理后会发生降解，抗氧化活性下降，促进氧化活性增加[65]。因此咖啡酸在高温处理后，咖啡酸起到的可能是促进氧化作用而非抗氧化作用。关于绿原酸保护心血管的机理，目前普遍认为是绿原酸的抗氧化活性能够提高机体的抗氧化状态以及降低低密度脂蛋白（low density lipoprotein， LDL）氧化水平，从而降低动脉粥样硬化的发病率，使机体避免患冠心病的风险。有学者研究表明绿原酸能够抑制炎症反应，从而可以降低绝经后妇女患心血管疾病以及其他炎症反应的风险[53]。然而，有研究表明高剂量（2 g/d）地摄入来自咖啡和红茶的绿原酸会显著增加血液中同型半胱氨酸的含量，而高水平同型半胱氨酸会提高机体患心血管疾病及中风的风险，因此应该尽可能避免摄入高剂量的绿原酸[65]。

4.3 类黑精安全性评价

4.3.1 类黑精的代谢过程

近年来有许多对来自于食品的类黑精在机体内代谢的研究[66-67]，但是由于类黑精合成过程以及结构的复杂性，并没有对类黑精代谢过程进行系统性的研究，只是对其代谢器官和代谢产物等进行了许多研究。大量研究[68-69]表明类黑精的代谢主要发生在肠道内，主要是肠道上的酶分子和微生物参与了代谢。低分子量类黑精的代谢程度高达30%，明显高于高分子质量类黑精；关于不能被分解吸收的结构复杂的高分子质量类黑精的作用和降解途径，有学者[70]提出了类黑精能够与诱变剂（异环式芳香胺）结合，从而能够降低机体诱变剂吸收的猜想。

4.3.2 类黑精的功能性和安全性

类黑精具有诸多生理功能，如抗氧化、抗菌、抗高血压、防龋齿、促进肠道菌群生长以及调节解毒酶系Ⅰ阶段酶和Ⅱ阶段酶，从而降低癌症、帕金森症以及慢性免疫功能紊乱综合症的风险[71-72]。类黑精的抗氧化机理要归结于其金属离子螯合能力以及清除自由基的能力，由于类黑精本身带负电，因此能够很好的和带正电的金属离子结合，从而阻止金属离子的促氧化过程[73]。Rufiá n-Henares等[74]采用类黑精对革兰氏阳性细菌、金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性细菌以及芽孢杆菌等8种细菌菌株的抑菌效果进行了研究，结果发现类黑精的抑菌性能主要与金属离子螯合性能有关，并且还具有3种不同的机理，机理1是类黑精在低浓度时，抑菌性能与培养介质中铁离子的螯合能力有关；机理2是如果细菌菌株能够产生铁载体对铁离子进行回收，那么类黑精螯合的铁载体主要是Fe3+复合物，从而降低致病菌的毒性；机理3是在高浓度时，类黑精能够将细菌外膜上的Mg2+脱除，从而对细菌外膜造成破坏，细胞质渗漏造成细胞死亡。类 黑精具有抗高血压的生理功能可能是与类黑精能够抑制血管紧张素转换酶的活性以及与熟知的具有抗高血压作用的多肽类药物功效相似有关；此外有研究发现延长烘焙时间所得到的类黑精对血管紧张素转换酶具有更好的抑制作用[75]。外源性有害异物在机体内的生物转化主要由两个步骤构成：功能化（氧激化形成活性位点）和共轭结合（添加 水溶性基团到活性位点）。这两个过程的调节由Ⅰ阶段酶和Ⅱ阶段酶来完成，最终有害异物转变为水溶性物质，通过胆汁和尿液排出体外。研究表明，类黑精能够显著地增加小鼠结肠细胞以及肾脏细胞中Ⅰ阶段酶和Ⅱ阶段酶的活性，从而对外源有害异物解毒，降低机体患癌症等疾病的风险[66]。虽然类黑精具有很多对机体有益的功能，但是也有学者对肺上皮细胞进行研究表明高剂量地摄入咖啡萃取物中的美拉德反应产物及高级糖基化终产物会引起活性氧基团的产生，从而调节细胞凋亡蛋白酶的活性，最终导致细胞死亡和细胞凋亡[76]。

5 结 语

凭借着独特的风味口感和诸多功能性成分，咖啡风靡于全世界。咖啡的功能性成分咖啡因、绿原酸和类黑精不仅对咖啡的色泽、风味和口感具有重要贡献，同时在醒脑提神、抗氧化、抗心血管疾病和治疗机体代谢疾病等生理学方面也具有重要的应用。目前对咖啡中功能性成分的分离技术方法主要有溶剂萃取法、吸附解吸和分配色谱法等。溶剂萃取法仍然是目前主要的方法，但随着对溶剂毒性的担忧以及产物纯度不高的局限，吸附解吸法和分配色谱法逐渐成为目前研究的热点。咖啡中功能 性成分的分析检测技术主要有液相色谱法、紫外分光光度计法、红外光谱法、电化学分子印迹聚合物检测法和毛细血管电动色谱法等。液相色谱法是目前主要的检测方法，但是由于准备样品麻烦以及检测时间较长，特别是近年来要求快速检测活性成分，电化学分子印迹聚合物检测法和毛血管电动色谱法开始成为目前研究的新方向。咖啡中的功能性成分具有诸多有益的生理学功能，但也有研究表明过多地摄取或对特定人群具有一定的危害性，特别对孕妇、胎儿发育以及儿童神经系统会产生一定的损伤或者干扰，因此合理摄取咖啡类食品应该引起人们的重视。

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Recent Advances in Technologies for the Separation, Determination and Safety Evaluation of Functional Components in Coffee

YANG Kai-zhou, ZHAI Xiao-na, DU Bing-jian, LENG Xiao-jing*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Coffee has been one of the largest consumed food commodities around the world due to its specific flavor, taste and physiological functions. The bioactive components in coffee with refreshing, anti-depression, antioxidant, antibacterial and anticancer ac tivities include caffeine, chlorogenic acid and melanoidins. Therefore, separation, determination and safety evaluation of functional components in coffee have become a hot topic among researchers. This article reviews the research progress in the separation, determination and safety evaluation of caffeine, chlorogenic acid and melanoidins in coffee. It can serve as a forefront scientific reference for the study and application of functional components in coffee.

coffee; caffeine; chlorogenic acid; melanoidins; extraction; determination; safety evaluation

TS273

A

1002-6630（2014）03-0243-10

10.7506/spkx1002-6630-201403049

2013-04-01

国家自然科学基金项目（31171771）

杨剀舟（1986—），男，博士研究生，研究方向为咖啡功能性及其产业化。E-mail：beyondykz1986@gmail.com

*通信作者：冷小京(1966—），男，副教授，博士，研究方向为可食用膜及微胶囊科学。E-mail：lengxiaojingcau@163.com