L-半胱氨酸抑制即食米饭黄变作用机制研究

赵培城 邓沙沙 吕 飞 丁玉庭

(浙江工业大学生物工程与环境学院，杭州 310014)

米饭是我国人民喜爱的主食之一，随着现代生活节奏加快，开发即食米饭已成为社会关注的焦点。国内外对即食米饭的开发进行了大量研究，但主要集中在生产工艺和干燥方法的技术改良方面。传统脱水米饭的工业化生产主要是采用脱水干燥方式延长保质期，在一定程度上降低了米饭的品质，如复水后口感较差，香味和营养损失等，因此开发保持新鲜烹调风味的常温即食米饭成为行业的发展趋势，此类型米饭用微波加热即可食用，但常温即食米饭贮藏过程中易出现色泽黄变现象，不仅影响米饭的感官品质，而且还会引起营养物质的损失、糠醛和5-羟甲基糠醛[1]等有害物质的生成。黄变现象的产生主要是即食米饭在加工和贮藏过程中还原糖与氨基酸、蛋白质之间发生了美拉德反应；含有氨基的化合物和含有羰基的化合物之间经缩合、聚合而生成类黑精[2]。

目前市场上的黄变抑制剂主要是亚硫酸化合物，但是亚硫酸对人体健康有害，为此出现了对还原型化合物如抗坏血酸及其衍生物、谷胱甘肽、L-半胱氨酸抑制黄变的效果的研究[3]。L-半胱氨酸是一种具有生理功能的氨基酸，是组成蛋白质的20种氨基酸中唯一独特且活泼(含巯基)的氨基酸[4-5]，能有效抑制蛋白质或其他氨基酸与糖发生美拉德反应。研究已发现L-半胱氨酸能有效抑制果蔬制品的非酶褐变[6]，但目前鲜有L-半胱氨酸对即食米饭黄变的抑制作用及相关机理的研究，因此，本试验通过研究L-半胱氨酸对即食米饭的品质影响，探讨其抑制即食米饭黄变的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

东北大米：市售，2012年粳米，五常市金福粮油有限公司，冰箱4 ℃储藏；L-半胱氨酸：食品级，河南明瑞食品添加剂有限公司；碳酸钠：食品级，宁波新之源化工有限公司。

1.2 仪器设备

DZQ-400真空包装机：上海申越包装机械制造有限公司；FreeZone 6L冷冻干燥机：美国Labconco公司；QE-100高速中药粉碎机：浙江武义县屹立工具有限公司；TA.XT Plus 物性测试仪：英国Stable Micro Systems公司；HunterLab Color Q色差仪：美国HunterLab公司；Hitachi S-4700电子显微镜：日本Hitachi公司；Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱仪：美国热电尼高力公司；X’pert PRO型X射线衍射仪：荷兰Panalytical公司；DSC-1差式扫描量热仪：德国Mettler Toledo公司。

1.3 即食米饭的蒸煮工艺

称取10 g大米，用蒸馏水清洗2遍，沥干，置入小铝盒中。按1∶1.3(W/W)的比例加入浸泡液，室温浸泡30 min，蒸煮40 min，焖制20 min ，制得即食米饭。试验用浸泡液分别为蒸馏水、0.03%L-半胱氨酸溶液及其钠盐(0.03%L-半胱氨酸用微量碳酸钠调制中性)溶液，分别标记为对照组(CK)、L-半胱氨酸组(EG)、L-半胱氨酸钠盐组(EC)(由于L-半胱氨酸含有羧基，考虑到pH的影响，设计EC组作为EG组的试验对照组)。

1.4 L-半胱氨酸对即食米饭品质的影响

1.4.1 即食米饭质构特性的测定

将蒸煮好的米饭样品冷却到室温后，用物性测试仪测定米饭蒸煮的硬度、黏性，测定条件：质构仪探头P36R；测前速度0.5 mm/s；测试速度0.5 mm/s；测后速度10 mm/s；压缩比例90%。测定时，每次从蒸煮好的米饭样品中间层的不同部位随机取出3粒米，对称放置在物性仪载物台上进行测定[7]。每种样品测定6次，去掉最大、最小测定结果，取4次测定结果并计算平均值、标准差。

1.4.2 即食米饭的感官评价

将蒸煮好的米饭样品，参照《粮油检验稻谷、大米蒸煮食用品质感官评价方法》GB/T 15682—2008[8]，选取10名品评员为米饭进行打分，品评米饭的气味(0～20 分)、外观结构(0～20 分)、适口性(包括黏性、弹性、软硬度)(0～30 分)、滋味(0～25 分)和冷饭质地(0～5 分)，综合评分为各项得分之和。

1.4.3L-半胱氨酸对贮藏过程中即食米饭色泽变化的影响

将1.3所制得的3组即食米饭，分别装入蒸煮袋中，进行真空包装；放入高压灭菌锅中高温121 ℃灭菌25 min，冷却后分别放置在55 ℃恒温下贮藏1个月(高温存储试验)[9]，在第0、3、6、10、13、16、20、25、30天取样，测定米饭样品的L(亮度)、a(红色度)、b(黄色度)。将色差仪的镜头口对准白板进行校正后，把米饭样品的表面置于被测部位[10]，样品经1次测定后，分别旋转120°和240°后再各测1次，重复测定3次，取平均值，观察ΔE(总色差)、b值的变化。

式中：Lo、ao、bo分别为每组米饭蒸煮灭菌后测得的色差值；Lt、at、bt分别为每组米饭贮藏一定时间后测得的色差值。

1.5 L-半胱氨酸对即食米饭微观性质的影响

1.5.1 电子显微镜

将所制得的3组即食米饭样品及生米真空冷冻干燥2～3 d，用粉碎机粉碎，过100 目筛，得米饭和生米的粉末状细小颗粒物，为米粉试样材料。

将试验所得的3组即食米饭的米粉与生米粉(BG)共4组样品分别用双面胶带粘在样平台上，镀金，在15 kv加速电压下观察并拍照[11]。

1.5.2 傅里叶红外光谱

用KBr压片法在4 000～400 cm-1分别对1.5.1试验所得的4组米粉样品进行红外扫描，得到红外光谱图[12-13]。

1.5.3 X射线衍射仪

将1.5.1试验所得的4组米粉样品分别用X射线衍射仪进行扫描，衍射角范围为10°～70°；步长为0.02；扫描速率为10 (°/min)；X射线源：Cu靶 Kα射线(λ=0.154 056 nm)；发射及防反射狭缝1°，接受狭缝0.3 mm；管压：40 kv，管流：40 mA[14]。

1.5.4 差示热量扫描仪

将生大米用粉粹机粉碎后过100目筛，得到生米米粉，分别称取200 mg与1.3步骤中的试验用浸泡液按1∶5(W/W)的比例混合均匀，密封后隔夜放置平衡，再进行DSC测试。测试参数：初始温度20 ℃，终止温度120 ℃，升温速率为5 ℃/min，氮气流量40 mL/min[15]。用To表示糊化起始温度，Tp表示糊化高峰温度，Tc表示相变最终温度，ΔH表示淀粉糊化的吸热焓。

1.6 数据分析

数据统计分析采用SSPS 17.0(Analytical Software公司)软件进行处理，结果表述为平均值±标准差。各处理间的数据采用单因素方差分析法分析，进行方差齐次性检验，并采用最小显著差数法(LSD)进行多重比较，取95%置信度(P<0.05)。

2 结果分析

2.1 L-半胱氨酸对即食米饭品质的影响

2.1.1L-半胱氨酸对即食米饭质构和感官品质的影响

L-半胱氨酸及其钠盐蒸煮对即食米饭质构和感官品质的影响如表1所示。EG组米饭硬度显著低于CK和EC组(P<0.05)，这可能是由于L-半胱氨酸酸性条件下，米粒的表面结构受到一定的侵蚀，大米淀粉结构遭到破坏，大米淀粉颗粒充分吸水膨胀，使得硬度减小。EG组米饭黏性比CK和EC组显著升高(P<0.05)，也是由于L-半胱氨酸酸性作用下，有利于淀粉在蒸煮过程中溶出，导致米饭黏性的增加。这与Shin等[16]的研究结果相一致，他们发现柠檬酸处理的大米淀粉包含支链淀粉的酸解物(包括直线型和分支结构) 和直链淀粉，淀粉的表观直链淀粉含量增加。赵国华等[5]发现加热会使蛋白质与含硫氨基酸之间发生巯基—二硫交换反应，改善食品的质地，如提高面团的黏弹性。本研究中发现L-半胱氨酸及其钠盐可以改善蒸煮米饭的感官指标，米饭的光泽度和黏弹性增加；大米经过L-半胱氨酸浸泡进行蒸煮，会发生酸解作用，从而降低部分支链淀粉和直连淀粉的分子量，使得米饭利于延伸并且透明、有光泽。Nakatani等[17]研究了以柠檬酸为主要组成成分的果汁也可以令米饭更透明，更有光泽并且更具有黏性。

表1 L-半胱氨酸对即食米饭质构和感官品质的影响

表2 L-半胱氨酸对贮藏过程中即食米饭ΔE和b的变化

注：不同小写字母表示同一处理条件、不同储藏时间下，即食米饭ΔE和b差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示同一储藏时间下、不同处理条件下，即食米饭ΔE和b差异显著(P<0.05)。

2.1.2L-半胱氨酸对贮藏过程中即食米饭色泽变化的影响

从表2中ΔE和b值的变化可以看出，即食米饭色泽值ΔE和b值在第10天后均出现较大幅度的变化(P<0.05)，且EG组和EC组即食米饭的ΔE和b值均显著低于CK组(P<0.05)，且EG组和EC组的ΔE和b值差异不显著(P>0.05)，表明L-半胱氨酸及其钠盐对贮藏过程中即食米饭的黄变现象均有一定的抑制作用。已有研究发现含巯基氨基酸对酶促和非酶促褐变都有强烈的抑制作用，以同样摩尔数添加，其效果与亚硫酸盐近似，Ozoglu等[3]研究发现L-半胱氨酸的巯基能与酚的氧化产物醌先加和，抑制含氨基化合物的加和，从而有效抑制褐变产物的形成，其机理与抑制非酶褐变近似。

2.2 L-半胱氨酸对即食米饭微观性质的影响

2.2.1 电子显微镜观察

即食米饭经L-半胱氨酸处理前后的微观结构如图1所示。BG组可以清晰地看见半晶体状的淀粉粒排列紧密且形状规则，但蒸煮后淀粉粒形态完全改变，淀粉颗粒膨胀已完全糊化形成絮状或小块状的蓬松物质[18]，这些物质相互交互成细微空隙，Pongthorn等[19]研究发现米饭的微观结构中孔隙越大，海绵状纹理的厚度越薄，米饭的硬度越大；有合适大小孔隙的米饭蓬松度和糊化程度均较好。本试验发现CK和EC组米粉表面比较光滑，形成的孔隙比较大，海绵状纹理的厚度较薄，因而米饭硬度比较大，这与表1中CK和EC组米饭硬度较大的结果相一致；图1中还可发现EG组的米粉粒表面被部分侵蚀而变得粗糙甚至出现浅层裂痕，是因为L-半胱氨酸含羧基呈酸性，使米淀粉内部结构受到破坏，这与李源等[20]研究柠檬酸对大米淀粉的微观结构影响的结果相一致。

2.2.2 傅里叶红外光谱分析

图1 即食米饭经L-半胱氨酸处理前后的SEM图

L-半胱氨酸处理前后米饭样品的红外光谱图如图2所示。BG组米粉在3 390、2 910、1 149 cm-1附近均具有强吸收峰，它们分别是氢键缔合伸缩振动吸收峰、碳氢键反对称伸缩振动峰、C-O-C 键伸缩振动峰；另外还有1 008、1 058、1 149 cm-1附近分别是伯醇、仲醇、叔醇的C-O伸缩振动吸收特征峰，以及584、752、838 cm-1附近处都是-CH2的摇摆振动吸收特征峰，上述这些峰都属于原淀粉的特征吸收峰[21]，但是除了原淀粉的吸收峰以外，米粉在1 510 cm-1处也有强峰，应为蛋白质的酰胺Ⅱ峰。经L-半胱氨酸处理后，EG和EC组蛋白质的酰胺Ⅱ峰由1 510 cm-1向1 565 cm-1附近偏移，这可能是L-半胱氨酸的巯基与蛋白质之间发生了二硫交换反应的缘故，另外，EG和EC组在1 764 cm-1附件处多了1个较强峰，应为C-S的伸缩振动峰，相关研究也发现L-半胱氨酸的巯基与羰基化合物会发生亲和加成反应生成C-S键，巯基硫原子极化形成的空d轨道重叠后亲核作用增强，因而在亲核加成反应中-SH的反应速度比-NH2高200～300倍，使羰基化合物优先于-SH加成反应而抑制褐变[5]。

图2 即食米饭经L-半胱氨酸处理前后的红外图谱

2.2.3 X-射线衍射分析

图3为L-半胱氨酸处理前后米饭样品的X射线衍射图谱，用X’Pert Highscore Plus软件寻找图3中的主要衍射峰并读出相应的峰强度，计算出结晶度于表3中。由BG组X射线衍射图谱及相关参数可以看出，大米淀粉是典型的A型淀粉图谱[22]，其在X射线衍射图谱上的特征峰对应的2θ角度值分别为15.14、17.28、18.58、23.08，这4个峰的强度均较高。各组峰的位置和强度变化不大，说明大米淀粉的结晶结构没有造成较大破坏，也没有改变大米淀粉的晶体类型，且每组的结晶度相对于生淀粉组都有所降低，说明大米糊化过程中结晶度会减小。CK和EC组的衍射图谱峰强度及位置发生了一些融合，具体表现为生淀粉的2个最强峰逐渐下降并融合，EC组比CK组的结晶度低，可能是因为巯基与羰基化合物发生亲和加成反应或是巯基与蛋白质发生二硫交换反应[5]，阻碍了糊化过程中对淀粉无定形区的破坏，同样L-半胱氨酸对米饭也有相同作用，但表3显示EG组的结晶度比CK组稍有增加，可能是因为L-半胱氨酸含有羧基，在酸性条件下，一方面起到了分解淀粉的作用，另一方面又会使无定形区部分消失。

图3 即食米饭经L-半胱氨酸处理前后的X-射线衍射图谱

2.2.4 差示扫描量热分析

表4为L-半胱氨酸及其钠盐蒸煮米饭的热力学参数表，相变初始温度To、吸热高峰温度Tp、相变最终温度Tc的大小与支链淀粉短链的长度有关，取决于结晶区的分子结构而不是结晶区的比例或支链淀粉/直链淀粉的比例[23]。由表3可以看出，EG和EC组米饭的To、Tp、Tc都稍有增加，说明在蒸煮过程中由于酸和热的双重作用下，样品的分子结构发生了变化但变化不大。半峰宽度Tp-To与微晶的形状与大小有关[24]，EC组的Tp-To与EC组相比变化不大，说明L-半胱氨酸钠盐处理米饭对微晶的稳定性影响较小；而EG组的Tp-To变大，说明EG组米饭的微晶形状和大小都发生了变化，从上述XRD分析中可知EG组比CK组结晶度增大，说明Tp-To变大伴随着微晶区比例的增大。吸热焓ΔH与淀粉在相变过程中双螺旋链的解开和熔融所需要的能量有关，EG和EC组的ΔH都变大，说明其中的双螺旋结构最稳定，这可能是L-半胱氨酸的巯基与糖基化合物发生亲核加成反应，并保护其双螺旋结构，使其更趋于稳定，发生相变就需要更多的能量。

表3 即食米饭L-半胱氨酸处理前后的主要衍射峰强度和结晶度

表4 L-半胱氨酸处理前后米饭的热力学性质参数

3 结论

米饭经L-半胱氨酸处理后，由于L-半胱氨酸的酸解作用，使米粉粒表面被部分侵蚀而变得粗糙甚至出现浅层裂痕，导致米饭的硬度减小；同时酸性条件下有利于蒸煮过程中淀粉的溶出，导致米饭的黏性增大。在傅里叶红外光谱中发现有新的化学键C-S键生成，L-半胱氨酸的侵蚀会使米淀粉结构的无定形区会部分消失，使得结晶度稍有增大，L-半胱氨酸处理后米粉的焓变ΔH增大，差示热量扫描与 X射线衍射得到的结论一致，都可推断L-半胱氨酸的巯基可能与米饭中的羰基化合物发生了亲核加成反应。由此可以得出L-半胱氨酸对即食米饭在贮藏过程中抑制黄变作用机制，即L-半胱氨酸的巯基与米饭中还原糖的羰基发生了亲核加成反应，抑制了蛋白质或其他氨基酸与糖发生美拉德反应。

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