胃癌组织中PIK3CA基因热点突变筛查及临床意义

郝兰香，潘 超*，蔡建春

(厦门大学 附属中山医院 1.病理科； 2.胃肠外科， 福建 厦门 361004)

磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位a(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha，PIK3CA)是目前3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)家族成员中发现的唯一可以发生体细胞突变而致癌的基因，约30%的人类实体瘤存在PIK3CA基因的突变[1]。胃癌作为中国最常见的恶性实体瘤之一，其发病率及病死率较高，其中基因突变在胃癌的发生、发展过程中起着非常重要的作用。鉴于相当一部分单核苷酸多态性的频率在不同民族、人群有显著差异，中国人群胃癌组织中是否存在PIK3CA基因突变？其突变频率与突变模式如何？目前国内未见大规模病例研究。本研究旨在检测中国人群胃癌组织中PIK3CA基因突变情况，探讨其突变与胃癌临床病理特征之间的关系，为胃癌的临床治疗、预后判断提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集厦门大学附属中山医院2007至2010年间行胃癌根治手术切除并经病理证实为胃癌的标本400例，患者均为中国人，年龄20～80岁。所获标本均征得患者知情同意。

1.2 主要试剂

石蜡组织DNA提取试剂盒(北京信然达科技有限公司)；人类PIK3CA基因突变检测试剂盒(厦门艾德生物医药公司)。

1.3 方法

1.3.1 组织DNA抽提：对入选病例石蜡包埋组织样本行5 μm厚切片，每例10片，切片置于4 ℃冰箱保存。按照石蜡组织DNA提取试剂盒操作说明提取DNA，使用紫外分光光度计对DNA进行定量。

1.3.2 荧光PCR法检测胃癌PIK3CA基因突变：人类PIK3CA基因突变检测试剂盒基于实时PCR平台结合了特异引物和双环探针两种技术，检测DNA样品中含有的突变基因。利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大。与此同时，利用双环探针对扩增产物进行检测，结合特别的PCR反应程序和高特异Taq酶的使用，在实时PCR平台上实现对样品DNA中突变的检测，以达到对稀有突变检测的高特异性和高灵敏度，即高的选择能力。具体操作按试剂盒说明书进行。

突变结果确定：首先确定样品各个反应管各自的突变Ct值，然后确定该样品的外控Ct值，根据不同的突变Ct值，把样品检测结果分为阴性、弱阳性及强阳性(表1)。

当样品突变Ct值大于或等于阴性临界值时，则该样品为阴性。当样品突变Ct值小于阴性临界值时，进行下列判断：

1)当某个反应管的突变Ct值小于阳性临界值时，则该样品为该反应管对应的突变阳性，即强阳。

2)当反应管的突变Ct值大于或等于阳性临界值时，则计算该反应管的ΔCt Cut-off值。若反应管的ΔCt值小于相对应的ΔCt Cut-off值，则该样品也为该反应管对应的突变阳性，即弱阳。反之，则为阴性。

1.3.3 基因突变类型分析：将筛查出的阳性病例PCR产物送往生工生物工程(上海)有限公司进行测序。

1. 4 统计学分析

分析PIK3CA基因突变与胃癌临床病理特征如肿瘤大小、组织学分级、淋巴结状态、患者年龄、预后(3年中位生存期)之间的关系采用χ2检验。统计处理采用SPSS18.0统计软件进行分析。

2 结果

2.1 胃癌PIK3CA基因突变检测结果

2.1.1 胃癌PIK3CA基因突变阳性病例筛选结果(荧光PCR)：400例胃癌标本中发现有30例发生了PIK3CA基因突变，突变率为7.5%，而作为对照的400例癌旁组织无1例发生基因突变，突变率为0。阳性病例荧光PCR结果截图如下(图1)。

表1 样品检测结果判定Table 1 Determination of sample test results

A.H1047R positive; B.E545K positive; C.H1047L positive; D.E542K positive 图1 胃癌PIK3CA检测阳性截图(荧光PCR) Fig 1 PIK3CA mutation(fluorescence PCR)

2.1.2 胃癌PIK3CA基因突变阳性病例测序结果(图2)和PIK3CA基因突变类型(表2)：30例阳性病例其突变位点主要集中在第9外显子(E542K，10例，占33%；E545K，6例，占20%)和第20外显子(H1047R，11例，占37%；H1047L，3例，占10%)，未检测到第9外显子E545D位点突变，此点与国外文献报道不同。

表2 中国人胃癌PIK3CA基因突变类型

2.2 PIK3CA基因突变与胃癌临床病理特征之间的关系

PIK3CA基因突变在肿瘤大小、组织学分级、淋巴结状态及患者年龄等组间比较无明显差异，而在预后组间有显著性差异(P<0.05)(表3)。

表3 PIK3CA基因突变与临床病理参数之间的关系

*P<0.05 compared with survival period ≤3 years.

A.H1047R; B.E545K; C.H1047L; D.E542K图2 胃癌中PIK3CA基因突变的测序结果Fig 2 PIK3CA mutation in gastric cancer

3 讨论

PI3K是脂质激酶，其介导的信号传导通路(PI3K/AKT信号通路)控制着众多在肿瘤发生发展中至关重要的细胞生物学过程，与人类多种恶性肿瘤的发生、发展和转归密切相关。PIK3CA是Ⅰ型PI3K的P110催化亚单位，即PI3K p110a的编码基因，定位于染色体3q26.3，长34kb，含20个外显子，是目前PI3K家族成员中发现的唯一可发生体细胞突变而致癌的基因。PIK3CA基因突变可导致PI3K p110a过度表达，引发PI3K/AKT信号通路持续活化，进而加速细胞周期、抑制细胞凋亡、增强化疗拮抗，以促进肿瘤发生发展[1]。

文献报道PIK3CA在包括结肠癌[2]、乳腺癌[3]、肝癌[4]等多种实体瘤中呈高频突变,除少数突变发生在第l外显子(P85a)外[5]，80%PIK3CA基因突变都集中在第9(螺旋区，包括E542K、E545K、E545D等突变类型)和第20(激酶区，包括H1047R，H1047L等突变类型)外显子的特异性位点上[6]。它的这种非随机高频突变也显示了其在肿瘤发生中的意义。

胃癌作为一种基因病，与多种癌基因的激活有关，在与胃癌发生发展密切相关的众多癌基因中，PIK3CA突变频率较高，其突变率可达14.3%[7]。实验结果显示，中国人群胃癌组织中也存在PIK3CA基因突变，但其突变频率(7.5%)和热点突变模式(主要位于E542K和H1047R位点，小部分在E545K和H1047L位点，无E545D位点突变)与国外文献报道存在差异，这可能与一些影响因素有关，如种族和地理差异、样本来源、储存与分离DNA的方法等。胃癌组织中PIK3CA基因突变明显影响着肿瘤的预后及治疗。PIK3CA基因突变患者较未发生PIK3CA基因突变患者之间，生存期存在显著差异，预后相对较差。提示，PIK3CA基因突变对胃癌预后判断具临床意义。此外，研究表明[8- 9]，靶向药物赫赛汀应用于HER- 2阳性胃癌患者，可明显提高患者的生存期，但存在PIK3CA基因突变患者却疗效不佳，究其原因是PIK3CA基因突变会导致肿瘤对靶向药物产生耐药。显示，PIK3CA基因突变对于靶向药物疗效预测具有重要意义。PIK3CA基因突变引发PI3K/AKT信号通路持续活化，通过多个环节促进肿瘤发生发展，PIK3CA成为肿瘤调控的一个关键点，将PIK3CA作为肿瘤治疗的一个新的分子靶点具潜在临床价值。

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