细胞自噬缓解氧-糖剥夺诱导原代培养小鼠脑皮质神经元缺血损伤

陈璐勔，罗艳琳，赵 丽，韩 松，李淑娟，李俊发*

(首都医科大学1.神经生物学系 北京脑重大疾病研究院，北京100069；2.附属北京朝阳医院神经内科，北京 100020)

自噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性降解途径，并被认为是细胞进行自我保护的一种重要机制[1]。关于自噬在脑缺血和缺血再灌注过程中的作用一直存在争议，一些研究者认为自噬在脑缺血损伤中起到保护作用；而另一些学者则认为自噬加重脑缺血损伤。究其原因，可能主要与研究者所选择的实验模型有关，即缺血/低氧或再灌注时间的差异可能造成不同的实验结果。如在大鼠脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型与原代培养皮质神经元中发现，自噬在缺血/再灌注中起保护作用，且这种保护作用不因再灌注时间的长短而改变[2- 4]。然而，其他研究者在不同实验条件下发现，随着氧-糖剥夺(oxygen glucose deprivation, OGD)时间的延长，自噬逐渐对细胞起损害作用[5- 6]。这些研究结果提示，缺血/低氧程度可能对于研究细胞自噬在脑缺血性损伤中作用有重要意义。据此，本实验拟利用原代培养小鼠脑皮质神经元OGD模拟离体缺血模型，选择不同OGD强度并利用自噬抑制剂巴弗洛霉素A1(BafA1)，探讨细胞自噬在OGD诱导神经元缺血损伤中作用，并为深入研究神经元在不同缺血强度状态下，自噬的具体细胞信号激活机制打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级， 出生24 h内的C57BL/6J乳鼠，雌雄不拘。购于首都医科大学动物部，SCXK(京)2012- 0001。

1.2 主要试剂

NeurobasalTM、B27、谷氨酰胺、双抗(100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)和无糖DMEM(Gibco公司)；BCA蛋白定量试剂盒(Pierce公司)，兔源性LC3多克隆抗体，Bafilomycin A1(Sigma-Aldrich公司)，兔源性Beclin- 1多克隆抗体和鼠源性β-actin单克隆抗体(Proteintech公司)，CytoTox 96®非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司), 3-(4,5-二甲基噻唑-2)- 2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(Applichem公司)。

1.3 神经元氧-糖剥夺(OGD)模型制备

选用培养8 d生长状态良好的神经元，更换为无糖培养基，放入37 ℃、通有混合气体(5% CO2, 2% O2和93% N2)的低氧培养箱。分别于15、30、60、90和120 min后取出，更换为正常培养液，并置于37 ℃、5% CO2饱和的常氧培养箱中继续培养24 h。为明确自噬在神经元OGD损伤中的作用，自噬抑制剂BafA1在细胞进行OGD前即刻加入，并在细胞培养基中保持终浓度为100 nmol/L。

1.4 Western blot检测

蛋白样品制备、SDS-PAGE和Western blot参照文献[14]。提取全细胞蛋白、BCA法定量。取30 g蛋白样品，进行电泳(12% SDS-PAGE,4 ℃,20～30 mA)和转膜(PVDF膜,400 mA,1 h)。先后用兔源性抗Beclin- 1(1∶1 000)、LC3(1∶1 000)和β-actin(1∶10 000)一抗，辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔二抗(1∶4 000)进行免疫杂交；然后用ECL发光，X-线片曝光、显影、定影。Western blot结果用Quantity One软件进行定量分析。

1.5 MTT比色法

将细胞接种于96孔板，经OGD处理后加入MTT，并避光37 ℃温浴4 h。MTT可被线粒体内脱氢酶还原生成结晶状深紫色产物甲臜(formazan)，用DMSO将其完全溶解后，通过酶标仪测定490 nm波长的吸光度(A490)，来计算细胞存活率。

1.6 乳酸脱氢酶(LDH)漏出率

在96孔板接种细胞，按照CytoTox 96®非放射性细胞毒性检测试剂盒规定步骤，定量测量(A490)细胞LDH漏出率，来确定细胞损伤水平。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 OGD处理对原代培养脑皮质神经元内自噬相关蛋白Beclin- 1表达水平和LC3Ⅱ/Ⅰ比值的影响

经15～120 min OGD/复糖复氧(R)24 h处理后，原代培养神经元内Beclin- 1蛋白表达水平随OGD处理时间延长显著升高，且于30 min达到峰值1.80±0.08倍 (P<0.05) (图1)。同样，代表自噬水平的LC3Ⅱ/Ⅰ比值在OGD处理后15～120 min的变化趋势与Beclin- 1蛋白表达水平相似，均在30 min OGD处理后达到峰值1.60±0.02倍 (P<0.05) (图2)。

2.2 自噬抑制剂BafA1对OGD处理神经元内自噬相关蛋白表达和缺血损伤的影响

选取自噬最为活跃的时间点，OGD 30和60 min/R 24 h，观察神经元损伤情况。MTT结果(图3A)示，30和60 min OGD/R 24 h神经元的存活率分可使神经元死亡率分别为(33.1±1.9)%和(39.9±1.4)%。然而，在终浓度100 nmol/L自噬抑制剂BafA1作用下，60 min OGD/R 24 h处理的神经元存活率下降为(49.3±1.5)%，较单纯60 min OGD/R 24 h处理神经元的存活率显著下降(P<0.05)，同样，LDH漏出率结果显示，BafA1抑制自噬后，30和60 min OGD/R 24 h处理神经元死亡率分别增加至(36.8±0.6)%和(51.2±1.5)%，且60 min OGD/R 24 h组神经元死亡率显著增加 (P<0.05) (图3B)。此外，进一步明确了BafA1对OGD处理神经元存活率和死亡率的影响是通过对细胞自噬的抑制作用(P<0.05) (图4)。

A.the typical result of Western blot showed the changes of Beclin- 1 (60 ku) expression in primary cultured cortical neurons with oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment; B.the results of quantitative analysis demonstrated that the Beclin- 1 expression increased;*P<0.05 conpared with 0 min OGD (normoxic control)

图1不同OGD处理时间对原代培养小鼠脑皮质神经元内Beclin-1表达水平的影响
Fig1EffectofOGDexposuretimeonBeclin-1expressionlevelinprimaryculturedcorticalneuronsofmice(n=6)

A.the typical result of Western blot showed the changes of LC3Ⅰ (17 ku) and LC3Ⅱ (14 ku) expressions in primary cultured cortical neurons with OGD treatment; B.the results of quantitative analysis demonstrated that the ratio of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ increased significantly with OGD exposure time；*P<0.05 compared with 0 min OGD (normoxic control)

图2不同OGD处理时间对原代培养小鼠脑皮质神经元内LC3Ⅱ/Ⅰ比值的影响
Fig2EffectofOGDexposuretimeonLC3Ⅱ/Ⅰratioinprimaryculturedcorticalneuronsofmice(n=6)

3 讨论

细胞自噬在脑缺血病理生理变化中扮演着重要的角色，明确自噬在脑缺血中发挥的作用是挽救缺血性脑卒中患者生命的关键[7- 10]。OGD致离体细胞缺血模型可解决整体动物实验难以解决的问题，并避免了诸多体内因素的干扰，非常便于观察药物的作用， 以及进一步探讨保护或损伤的细胞分子机制。

A.the results of MTT(cell survival); B.LDH(cell death) assaies demonstrated that autophagy inhibitor BafA1could significantly aggravate 60 min OGD/24 h R-induced ischemic injury in primary cultured cortical neuron of mice;*P<0.05 compared with normoxia;#P<0.05 compared with 60min OGD without BafA1treatment

图3自噬抑制剂BafA1对30～60minOGD处理神经元缺血性损伤的影响

Fig3EffectofautophagyinhibitorBafA1on30～60minOGD-inducedischemicinjuriesinprimaryculturedcorticalneuronofmice(n=6)

The results of typical Western blot and quantitative analysis showed that the autophagy inhibitor BafA1, which is a specific inhibitor of vacuolar H+ ATPase to prevent the fusion between autophagosomes and lysosomes, could significantly induce the accumulation of LC3II in primary cultured cortical neurons after 60 min OGD/24 h R;*P<0.05 compared with normoxia;#P<0.05 compared with 60 min OGD

图4自噬抑制剂BafA1对60minOGD处理神经元内LC3Ⅱ/Ⅰ比值的影响

Fig4EffectofautophagyinhibitorBafA1ontheLC3Ⅱ/Ⅰrationinprimaryculturedcorticalneuronsafter60minOGDtreatment(n=6)

因此，原代培养小鼠脑皮质神经元OGD模型，可研究缺血/缺氧时神经元自噬是否被激活及其激活程度，更重要的是能更直接地研究神经元自噬在缺血/缺氧性损伤中作用，为深入研究脑缺血/低氧性损伤和适应机制打下了良好基础[11- 14]。本研究结果表明，离体培养神经元经OGD/24 h R处理后， OGD1 5 min即可诱发原代培养小鼠脑皮质神经元的自噬发生，OGD 30 min即可使神经元内自噬水平达到峰值，然而随着时间的延长，神经元自噬水平略微下降，损伤情况加重，提示神经元的损伤方式可能已发生了改变，即凋亡和坏死途径被触发。而细胞自噬可缓解OGD致小鼠脑皮质神经元的缺血性损伤，并在60 min OGD/R 24 h的保护作用更明显。

总之，本实验在原代培养神经元的缺血性损伤中证实，自噬可以对抗OGD致神经元的损伤作用，且这种作用与时间密切相关，随着OGD时间的延长，其他细胞死亡方式被触发，自噬的保护作用被削弱。提示临床上治疗缺血性脑卒中不仅要在合适的时间点发挥自噬的保护作用，还要注意抑制其他细胞死亡方式的发生。总之，OGD可诱发原代培养小鼠脑皮质神经元自噬发生，且细胞自噬可缓解OGD处理脑皮质神经元的缺血损伤。

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