异甘草素增强大鼠脑基底动脉平滑肌细胞BKCa电流

田伟伟，王 蕊，张传林，赵 磊，马克涛，李 丽，司军强

(石河子大学 医学院 1.生理教研室；2.新疆地方与民族高发病教育部重点实验室, 新疆 石河子 832002)

缺血性脑血管病约占脑血管病的80%，脑缺血后引起的脑卒中、血管性痴呆和认知功能障碍合并阿尔茨海默病等严重威胁人类健康[1]。大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium-activated potassium channels; BKCachannel; BKCa)是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)上具有负反馈调节的重要K+通道。BKCa通道的激活会产生一个瞬时外向钾电流，使VSMC膜电位发生超极化，导致血管舒张[2]。异甘草素(isoliquiritigenin, ISL)源于豆科植物甘草的根, 串果藤和香殊兰的球茎等，具有抗肿瘤、抗氧化和抗感染等作用[3]，对脑缺血再灌注损伤和老年性痴呆也具有改善和保护作用[4]，但其对脑血管的作用及其机制尚不清楚。本研究观察ISL对Wistar大鼠脑基底动脉VSMC BKCa通道的调节作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠，SPF级，雌雄不拘，体质量为200～300 g(新疆自治区疾病控制中心动物饲养科提供，许可证编号SCXK 新2011- 0001)。

1.2 试剂

所用药物用DMSO 液配制，通过开关控制药物灌流速度、温度和其他成分。ISL(纯度>98%)、四乙胺(tetraethyl ammonium，TEA)、苯肾上腺素(phenylephrine，PE)(Sigma公司)，其余均为国产分析纯试剂。

1.3 单个脑基底动脉VSMC的制备

给大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉后，断头处死，迅速取脑，置于预先配制的细胞外液中，快速取出脑基底动脉并将周围结缔组织分离。单个脑基底动脉VSMC的制备参照文献[5]。

1.4 脑基底动脉直径的测量

脑基底动脉血管段操作方法参照文献[6]，血管段在水浴槽中孵育20 min稳定后，分别给予1×10-5mol/L PE(1)、1×10-5mol/L PE+1×10-4mol/L ISL和1×10-5mol/L PE(2)，记录血管段直径的变化。

1.5 全细胞膜片钳记录技术

在室温条件下(22 ℃～25 ℃) 使用Axon700B放大器(Axon公司)进行单个脑基底动脉VSMC全细胞膜片钳实验，全细胞膜片钳技术参照文献[7]。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 ISL舒张大鼠脑基底动脉

1)用PE(1)(1×10-5mol/L)0.9%氯化钠溶液(physiologic salt solution, PSS)灌流后，血管直径为 (320±11)μm；2)用ISL(1×10-4mol/L) 和PE(1×10-5mol/L) 的PSS液体灌流后，血管直径为(379±10)μm；3)用PE(2)(1×10-5mol/L) 的PSS液体再次灌流后，血管直径为(332±10)μm(图1A)。与1×10-5mol/L PE(1)组和1×10-5mol/L PE(2)组相比，1×10-5mol/L PE+1×10-4mol/L ISL组的血管直径明显增大(P<0.05)(图1B)。

A:1.the isolated cerebral basilar artery was incubated with PE(1×10-5 mol/L) for 20 min, and the diameter was 309 μm, 2.after perfusion with PE (1×10-5 mol/L) and ISL(1×10-4 mol/L), the diameter was 399 μm, 3.after washing with PE(1×10-5 mol/L) for 20 min, the diameter was 304 μm, that indicated ISL relaxed the cerebral basilar artery; B:ISL relaxed cerebral basilar artery (n=6); *P<0.05 compared with control[1×10-5 mol/L PE(1) and 1×10-5 mol/L PE(2)]图1 异甘草素舒张脑基底动脉Fig 1 ISL relaxed the cerebral basilar artery

2.2 ISL呈电压依赖性增强脑基底动脉VSMC外向电流

在0～60 mV区间内，ISL(1×10-4mol/L)呈电压依赖性增强脑基底动脉VSMC外向电流(表1，图2)。

表1 ISL呈电压依赖性增强血管平滑肌细胞外向电流Table 1 ISL enhanced outward currents of VSMCs in voltage-dependent manner (±s，n=6)

*P<0.05,**P<0.01 compared with control.

A.10-4mol/L ISL increased the outward currents of VSMC in voltage-dependent manner from 0～60 mV, B.ISL enhanced the outward currents；*P<0.05,**P<0.01compared with control

图2ISL呈电压依赖性增强脑基底动脉VSMC外向电流
Fig2ISLenhancedoutwardcurrentsofVSMCinvoltage-dependentmanner(n=6)

2.3 ISL呈浓度依赖性增强脑基底动脉VSMC外向电流

1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4和3×10-4mol/L ISL使VSMC电流(+60 mv)分别从(144±25)pA增加到(156±24)pA、(173±24)pA、(211±21)pA、(252±21)pA和(262±20)pA(图3A)。与对照组相比，除1×10-7mol/L ISL组外，其余各组外向电流呈浓度依赖性增强(P<0.05)(图3B)。

2.4 ISL增强由BKCa介导的脑基底动脉VSMC外向电流

预灌流1×10-3mol/L TEA 3 min，再给予1×10-3mol/L TEA+1×10-4mol/L ISL，ISL增强VSMC外向电流的作用被阻断，且外向电流(+60 mV)减小到(86±22)pA(图4A)，只有对照组的0.65±0.04倍(P<0.05)(图4B)。

3 讨论

ISL属于黄酮类化合物，可引起豚鼠气管平滑肌的舒张，具有解痉及平喘的功能[8]。本结果显示ISL可以舒张大鼠脑基底动脉，呈电压依赖性和浓度依赖性增强脑基底动脉VSMC外向电流。BKCa通道阻断剂TEA不仅阻断了ISL对脑基底动脉VSMC外向电流的增强作用，而且明显减小了对照组外向电流幅值。提示ISL可通过激活BKCa通道，引起K+外流，从而促使VSMC超极化发挥扩张血管的作用。

ISL在1～100 μmol/L范围内呈浓度依赖性增强大鼠主动脉中可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的活性，显著提高cGMP的含量，少量增加cAMP的含量[9]。cGMP和cAMP可以使BKCa通道相关蛋白发生磷酸化和增强钙火花频率，导致BKCa通道的激活，从而使平滑肌产生舒张效应[10]。

A.with the increase of ISL concentration, the outward currents of VSMC enhanced; B.ISL enhanced the outward current, EC50of ISL enhanced the VSMC outward current was 9.5 μmol/L;*P<0.05 compared with control

图3ISL呈浓度依赖性增强脑基底动脉VSMC外向电流
Fig3ISLenhancedtheoutwardcurrentsofVSMCinconcentration-dependentmanner(n=6)

A.TEA(1×10-3mol/L) inhibited ISL-induced (1×10-4mol/L) outward currents of VSMC; B.effect of TEA on ISL-induced outward currents;*P<0.05,**P<0.01 compared with control

图4ISL增强BKCa通道介导的外向电流
Fig4ISLenhancedtheoutwardcurrentsmediatedbyBKCachannel(n=6)

VSMC内游离Ca2+主要贮存在肌质网(sarcoplasmic reticulum, SR)，胞内Ca2+的释放主要由SR上IP3受体和ryanodine受体调控[11]。ryanodine受体介导的钙诱导的钙释放(Ca2+-induced Ca2+release,CICR)和IP3受体介导的钙释放[inositol 1,4,5-trisphosphate(IP3)-induced Ca2+release, IICR]产生的局部钙瞬变如钙火花(Ca2+sparks)可以激活胞膜上BKCa通道，产生自发性瞬时外向电流(spontaneous transient outward currents, STOCs)，胞膜发生超极化，进而发挥舒血管效应[12]。而钙火花和STOCs与SR中的钙负荷有紧密联系，当SR中钙离子负荷低于静息水平60%时，钙火花和STOCs的幅度和频率会明显减小，增加SR中的钙负荷会显著增强钙火花的幅度和频率，这可能是SR内钙离子驱动力的改变导致的[13]。PKG可以使SR上的钙泵(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA)相关蛋白(phospholamban, PLB)发生磷酸化，促进钙泵对钙的摄取，增加SR内的钙离子负荷[14]。且蛋白激酶G(protein kinase G, PKG)和蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)可以通过增加SR内钙离子负荷来增强钙火花的钙离子敏感性，从而增强BKCa通道的活性[15]。所以，ISL引起大鼠脑基底动脉VSMC胞膜BKCa介导的外向电流增加的机制可能是：ISL增加胞内cGMP和cAMP含量，一方面使BKCa通道相关蛋白发生磷酸化，直接激活BKCa通道；另一方面增加胞内SR的钙负荷，增强钙离子敏感性和钙火花的频率，增强BKCa通道的活性。

本实验发现ISL增强大鼠脑基底动脉VSMC BKCa通道介导的外向电流，从而引起VSMC发生超极化发挥舒血管作用，但其对脑基底动脉中cGMP和cAMP含量的影响及其机制还需进一步研究。

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