肝癌组织中KLF17的表达及临床意义

孙 昭，赵 林，周 娜，高鹤丽，马春亮，韩 钦

(中国医学科学院 1.北京协和医院 肿瘤内科,北京 100730；2.基础医学研究所 组织工程研究中心，北京 100005)

肝癌已成为全球第5种最常见的恶性肿瘤[1]，在中国肝癌发病率男性居第5位,女性居第6位；病死率男性居第2位,女性居第5位。因此肝癌在中国目前是仅次于肺癌的最主要恶性肿瘤,每年发病和死亡人数分别约36万和35万,并有继续增高的趋势[2]，研究肝癌的分子生物学标志物，可以为肝癌的预后的预测提供新的指标或者为肝癌的治疗提供新的靶点。Kruppel样转录因子kruppel-like factors,KLFs)是一类具有锌指结构的转录因子,其典型结构特征是在其羧基端具有3个C2H2锌指结构，广泛参与细胞的增殖、凋亡、分化等的调控。KLFs不仅在生理过程中有重要的作用，近来的研究发现在肿瘤的发生和发展过程中也起到重要的作用，KLF家族的新成员KLF17已经在多种肿瘤中被证明为一种抑癌基因，其表达的下调和肿瘤的转移复发相关。在胃癌[3]，肺癌[4]和乳腺癌[5]组织中KLF17的表达均低于癌旁的正常组织，而且在肿瘤组织中KLF17表达高的患者生存期更长。在既往的研究中[6- 7]发现KLF17在肝癌细胞系中可以通过促进上皮间质转化，从而促进肝癌细胞的侵袭和迁移。为了进一步研究KLF17在肝癌中的作用，首先研究了KLF17在肝癌组织中的蛋白水平的表达和患者预后的关系，然后在肝癌原代培养的细胞中研究了KLF17的功能。

1 材料与方法

1.1 临床资料

2009年1月至2011年12月在北京协和医院肝胆外科手术的肝细胞肝癌者，经病理科确诊为肝细胞肝癌，全部为R0切除，有明确的随访结果，可以进行评估的患者一共36人，其中男性29人，女性7人；平均年龄55.2±11.5，(中位年龄56岁)；KPS分均≥80，根据巴塞罗那分期，A期 18人(50.0%)，B期13人(36.1%)，C期5人(13.9%)；病理低分化16人(44.4%)，中分化12人(33.3%)，高分化8人(22.3%)；甲胎蛋白≥400 U/mL的19人(52.8%)。随访截至2013- 06- 30，中位随访时间25个月。

1.2 免疫组合法检测KLF17在肝癌组织中的表达

石蜡组织切片常规脱蜡，柠檬酸缓冲液微波修复，过氧化氢阻断内源性过氧化物酶的活性，山羊血清封闭，加抗KLF17的抗体(Genetex)，4 ℃过夜。加生物素标记的二抗，室温下孵育60 min。加链霉素抗生物素，室温下孵育30 min。DAB显色，封片，在显微镜下观察计数阳性细胞。免疫组合染色评分标准: 不着色0分, 浅棕色1分,棕色2分。阳性细胞所占比例评分标准: 阳性细胞数<10%者0分;10%～40%者1分;40%～70%者2分; ≥70% 者3分。两种评分相加0～2分为低表达; 3～5分为高表达。

1.3 肝癌原代细胞系

Hep11和Hep12细胞系分别分离自同一肝细胞肝癌患者的原发灶和复发转移灶(北京大学肿瘤医院王歈博士赠送)。培养体系为RMPI1640培养基加20% FBS。

1.4 肝癌细胞侵袭和迁移实验

肝癌细胞侵袭和迁移实验在Transwell(Costa)小室中进行，侵袭实验的小室预先铺ECM胶。培养的细胞常规消化计数，用无血清培养基重悬，200 μL的细胞悬液(1×106cells/mL)在转染48 h后加入Transwell的上室，下室加入含20%胎牛血清的1640培养基500 μL，分别在24和72 h后固定，结晶紫染色，显微镜下计数。

1.5 RNA抽提和定量PCR检测

Trizol法抽提总RNA，并反转录为cDNA，KLF17表达水平用定量PCR的SYBR法检测，内参为GAPDH。KLF17的引物序列为5′-CCAACCATTCAG CACTTTCCT-3′; 5′-AGTAGCTCATACCACGCTCAG-3′；GAPDH的引物序列为5′-GGTCACCAGGGCTGC TTTTA-3′; 5′-GAGGGATCTCGCTCCTGGA-3′。

1.6 蛋白质提取和Western blot检测

提取细胞总蛋白，经BCA法定量，各组取40 mg总蛋白进行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转到PVDF膜上， KLF17一抗(Genentex)1∶1 000 4 ℃过夜，内参为GAPDH(Santa Cruz)，二抗室温孵育1 h，ECL荧光显色，照相。

1.7 肝癌原代细胞Hep11的KLF17表达的干扰

KLF17的干扰的靶序列为5′-CGACAGTACCTT CTGACGAAAC-3′，转染用Amaxa Nucleofector®核电转仪转染，程序为T028。

1.8 统计学分析

采用SPSS软件(版本19.0)，计量资料采用(均数±标准差)，计量资料用成组t检验，计数资料用卡方检验或四格表确切概率检验，生存数据分析采用Kaplan-Meier法和寿命表法，组间比较采用Log-rank检验；对影响生存预后的联合效应采用Cox回归模型进行多因素分析。

2 结果

2.1 KLF17在患者肝癌组织中的表达

在36名肝癌患者中，免疫组化检测KLF17，其中有19人(52.8%)为3～5分，17人(47.2%)0～2分，KLF17免疫组化染色的结果见图1，KLF17的表达和患者的性别，KPS评分，巴塞罗那分期，分化，AFP值等临床特征无关。

2.2 Cox回归分析各种危险因素对肝癌患者预后的影响

Cox回归分析了性别，年龄，甲胎蛋白，分化程度，巴塞罗那分期，术后介入化疗，KLF17表达对患者无进展生存(disease free survival，DFS)和总生存(overall survival,OS)的影响，其中巴塞罗那分期和KLF17对DFS和OS有影响，发现巴塞罗那分期在DFS的相对危险度(relative risk，RR)为3.1，P<0.05，KLF17 3～5分的RR为0.2，P<0.05，其他因素没有统计学差异，而在OS中，巴塞罗那分期的RR为5.6，P<0.05，KLF17的RR是0.1，P<0.05，其他因素没有统计学差异。

2.3 单因素分析KLF17对DFS和OS的影响

根据KLF17表达情况分为两组， KLF17免疫组化评分0～2分的DFS为23.4±4.9个月(95%可信区间为13.2～32.3个月)，3～5分的DFS为39.3±4.2个月(95%可信区间为31.1～47.5个月)，P<0.05。KLF17评分为0～2分的OS为35.2±4.2个月(95%可信区间27.0～43.4个月)3～5分的OS为46.9±3.2(95%可信区间40.1～53.2个月)，KLF173～5分和0～2分的DFS和OS均有显著性差异(P<0.05)。

2.4 Hep11和Hep12肝癌细胞迁移和侵袭的比较

培养自肝癌转移复发灶的Hep12的迁移和侵袭能力显著高于Hep11(P<0.05, 图2A，B)，而Hep12的KLF17在mRNA和蛋白水平均显著低于Hep11(图2C，D)。

2.5 Hep11细胞KLF17干扰后迁移和侵袭能力上调

Hep11细胞转染KLF17的干扰序列后，定量PCR和Western blot检测干扰有效(图3A，B)，KLF17干扰组和无关序列干扰组比较迁移和侵袭能力显著增加(P<0.05)(图3C，D)。

3 讨论

本研究首先用免疫组化法检测了肝癌患者石蜡包埋保存的肿瘤组织中KLF17的表达，发现KLF17主要表达于肝癌细胞的细胞质中，而KLF17的表达和患者的分期，分化，性别，甲胎蛋白等都没有相关性，但是KLF17表达免疫组化评分高于3分的患者，无进展生存期和总生存期均较长，从而证实了KLF17在蛋白水平的表达和肝癌预后有显著的相关性，这和以前报道的肝癌新鲜冰冻组织中KLF17mRNA表达较高的患者5年生存率更高的结果是一致的[6]。

为了进一步研究KLF17调控肝癌转移和复发的机制，从同一患者原发灶和复发转移灶分离出来的Hep11和Hep12原代培养的肝癌细胞被选中为研究对象，在体外研究中发现Hep12的迁移和侵袭能力显著高于Hep11，而且Hep12的KLF17在mRNA和蛋白水平的表达均显著低于Hep11，那么KLF17表达水平是否影响肝癌的侵袭迁移能力呢，进一步研究发现，利用RNA干扰技术下调KLF17表达后，Hep11迁移和侵袭能力显著增强，从而证明KLF17在肝癌中确实具有调控转移的功能。

A.negative; B.light brown; C.brown 图1 肝癌的KLF17的免疫组化Fig 1 Immunohistochemistry of KLF17 inHepatocellular carcinoma(×400)

A.microscopic image of crystal violet staining of transwell (compare the migration and invasion of Hep11 and Hep12; B.transwell migration (n=4) and invasion (n=4) assays showed that Hep12 had greater migratory and invasive potentials than Hep11，*P<0.05 compared with Hep11; C.KLF17 protein expression in Hep11 and Hep12; D.KLF17 mRNA expression in Hep11 and Hep12,*P<0.05 compared with Hep11

图2Hep11和Hep12迁移侵袭以及KLF17表达的比较
Fig2ComparisonofHep11andHep12characteristics(×200)

A.Western blot showed that KLF17 were down regulated in Hep11 cells transfected with the KLF17 siRNA; B.real time PCR showed that KLF17 were down regulated in Hep11 cells transfected with the KLF17 siRNA,*P<0.05 compared with control; C.microscopic image of crystal violet staining of transwell (compare the migration and invasion of Hep11 transfected with KLF17 siRNA and control; D.transwell migration (n=4) and invasion (n=4) assays showed that Hep11 cells that were transfected with the KLF17 siRNA (200 nmol/L) had greater invasive and migratory potentials than the control,*P<0.05 compared with control

图3Hep11的KLF17干扰后侵袭和迁移增加
Fig3KLF17regulatedHep11cellmigrationandinvasion(×200)

总之，肝癌细胞质高表达KLF17是肝癌预后较好的独立预测因素之一，其机制可能是KLF17具有抑制肝癌细胞转移的功能。

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