miR- 196a- 5p抑制小鼠胚胎干细胞的自我更新

赵华路，姚 南，魏雪菊，王兰兰，张俊武，黄 粤，余 佳

(中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 国家医学分子生物学重点实验室， 北京 100005)

胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)因其具有在体外可无限增殖并可分化为体内任何种类细胞的潜能而被广泛研究[1]。microRNA (miRNA)作为细胞内一类重要的非编码调控分子，许多miRNA已被证实参与了ESC及iPS细胞的产生和分化过程，并在其中发挥关键作用[2- 6]。将ESC中miRNA产生和成熟的关键基因Dicer或DGCR8敲除后，ESC均表现出增殖能力不同程度的减弱，且均不能正常向3个胚层分化，而丧失其全能性[7- 8]。说明miRNA在ESC的自我维持尤其是分化中具有非常关键的作用。且Dicer-/-和DGCR8-/-ESC因可以作为研究miRNA功能的有利工具[7]。

小鼠胚胎干细胞 (mouse embryonic stem cells，mESC) 早期分化的microRNA测序数据显示miR- 196a- 5p在胚状体(embryoid body, EB)发育过程中表达上升[9]，但其在mESC中的具体功能及机制仍然未知。因此，本研究在DGCR8-/-mESC中重新引入了miR- 196a- 5p的表达，检测了miR- 196a- 5p重新表达后对于mESC自我更新能力的影响，确定了miR- 196a- 5p在抑制mESC增殖及自我更新中的功能。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

野生型小鼠胚胎干细胞系V6.5及DGCR8-/-小鼠胚胎干细胞系ES1(北京大学分子医学研究所汪阳明教授惠赠)，白血病抑制因子(LIF)(ESG1107，Millipore公司)，DharmaFECT1(Dharmacon公司)，miR- 196a- 5p mimics 及对照(Dharmacon公司)，碱性磷酸酶检测试剂盒(86R- 1KT，Sigma公司)，Trizol及反转录试剂盒(Invitrogen公司)，实时定量PCR所用试剂(Takara公司)。实验中所用抗体分别为：Oct4抗体(sc- 5279，Santa Cruz)，TRITC山羊抗鼠IgG(ZF- 0313，中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 mESC的培养及诱导分化

mESC培养于M15培养基(15%胎牛血清，2 mmol/L GlutaMAX，0.1 mmol/L 非必需氨基酸，0.1 mmol/L β-巯基乙醇，1 000 U LIF)，经0.1% Gelatin处理的细胞培养板中。

拟胚体(embryoid body，EB)形成实验：将处于对数生长期的V6.5细胞以(1～1.5)×106细胞/10 cm培养皿的密度接种，使用10 cm Petri Dish培养皿，培养基为15%胎牛血清的DMEM培养基。每天轻轻摇动培养皿，在EB生长的不同天收集细胞，检测miR- 196a- 5p的表达。

维甲酸(retinoic acid，RA)诱导分化：诱导前1天，将处于对数生长期的V6.5细胞以6×104细胞/10 cm皿的密度接种。诱导当天，培养基更换为无白血病抑制因子，添加终浓度为0.5 mmol/L RA的培养基中，每天换液。于诱导第2、4和6天收集细胞，用于检测miR- 196a- 5p的表达水平。

1.3 mESC的转染

转染前1天，ES1细胞以1×105细胞/孔(6孔板)的密度接种于培养板上，培养于无双抗的M15培养基。转染当天，按照DharmaFECT 1操作说明进行转染，转染3 d后收集细胞，检测各指标。

1.4 实时定量PCR

在分化的不同时间点收集细胞，根据Trizol操作说明，提取细胞总RNA。提取的总RNA定量后，使用反转录试剂盒合成cDNA第一链。使用适量的cDNA作为PCR模板，BioRad CFX- 96进行PCR反应，SYBR染料实时检测扩增产物的量，以U6为内参分析miR- 196a- 5p表达情况。所使用引物序列(表1)。

1.5 集落形成实验

以500细胞/孔(6孔板)的密度接种ES1细胞，待其生长至第5～6天，进行碱性磷酸酶染色。首先4%多聚甲醛固定1～2 min，用1×TBST漂洗1遍，加入新鲜配制的反应液，室温避光放置30 min。弃去反应液，用1×TBST漂洗1遍。计数阳性克隆数。

表1 Real-time PCR引物Table 1 Primer sequence used for real-time PCR

1.6 流式细胞术检测细胞周期

消化收集ES1细胞，用预冷的PBS洗1遍，用100 μL PBS重悬细胞沉淀。逐滴加入400 μL预冷的无水乙醇。4 ℃固定过夜。取上述固定好的ES细胞，500 μL PBS(含有1%胎牛血清)漂洗一次，100 μL PBS重悬，5 μL RNase A(0.5 g/L)，37 ℃，温育30 min。加入12 μL 10×PI溶液(PI 500 μg/mL，0.9% NaCl，1% Triton®X- 100)，4 ℃染30 min。加入500 μL PBS，使用流式细胞仪进行检测，测定488 nm吸光度值。

1.7 Oct4免疫荧光染色

将ES1细胞接种到Laminin预处理(0.5 μg/cm2Laminin于37 ℃处理2 h以上)的细胞爬片上。待细胞在爬片上达到合适的密度，用预冷的PBS洗两次。4%多聚甲醛固定15 min。PBS洗细胞3次，0.5% Triton X- 100透膜10 min，3% 牛血清白蛋白室温封闭1 h。1∶100稀释的Oct4一抗孵育，4 ℃过夜。PBS洗细胞3次，1∶400稀释的二抗室温孵育1 h。PBS洗细胞4次，并反扣于滴加DAPI的载玻片，避光孵育30 min，于荧光共聚焦显微镜下观察拍照。

2 结果

2.1 miR- 196a- 5p在V6.5细胞分化过程中上调

在模拟胚胎早期分化的EB形成过程中，miR- 196a- 5p表达逐渐上升，在EB形成的第8天达到最高， 表达量为ES细胞中的9倍(P<0.001)(图1A)。在RA诱导的mESC分化过程中，miR- 196a- 5p的表达量也逐渐升高，分化第6天的表达量为ES细胞中的4倍(P<0.01)(图1B)。

2.2 miR- 196a- 5p能够抑制ES1细胞的克隆形成能力

过表达miR- 196a- 5p的ES1细胞的集落形成能力与对照相比明显下降，所形成的克隆数量及细胞的AP活性均明显下降(图2A)。且AP染色为阳性的细胞克隆中分化的集落比例明显增加，未分化状态的克隆数量以及总集落数量均明显减少(图2B)。

2.3 miR- 196a- 5p可抑制ES1细胞周期进行

mESC增殖旺盛，细胞周期的分布具有G1期短，S期长的特点。过表达miR- 196a- 5p的ES1细胞较对照组而言，G1期比例明显增加，S期比例下降，说明miR- 196a- 5p的过表达能够抑制G1-S的转换，抑制细胞增殖(图3)。

2.4 miR- 196a- 5p能够抑制ES1细胞的碱性磷酸酶活性及Oct4表达

mESC细胞呈AP染色阳性，在ES1细胞中过表达miR- 196a- 5p 后AP染色着色较浅，AP活性明显下降，且细胞丧失集落形态(图4A)。同时检测了维持mESC多能性及自我更新的关键转录因子Oct4的表达水平，Oct4免疫荧光染色中红色信号表示Oct4表达强弱，蓝色信号为细胞系，从图中可知miR- 196a- 5p 的过表达也导致了Oct4水平的下降(图4B)。

A.the expression of miR- 196a- 5p during EB differentiation of mESCs at 2, 4, 6, 8 and 10 days；B.the expression of miR- 196a- 5p during RA-induced differentiation of mESCs at 2,4 and 6 days;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with 0 day

A.colony formation assay of microRNA mimic transfected mESCs; B.number of differentiated and undifferentiated colonies in microRNA mimic transfected mESCs;*P<0.01 compared with scramble control

图2miR-196a-5p抑制mESC的克隆形成能力
Fig2miR-196a-5psuppressedthecolonyformationofmESCs(n=3)

The cell cycle distribution of mESCs transfected with microRNA mimics; *P<0.01 compared with Scramble control 图3 miR- 196a- 5p可抑制mESC细胞周期进行Fig 3 miR- 196a- 5p inhibit cell cycle progression of mESCs(n=3)

A.miR- 196a- 5p suppressed AP activity of ES1 cell compared with the scramble control； B.miR- 196a- 5p suppressed Oct4 expression of ES1 cell compared with the scramble control

图4miR-196a-5p能够抑制mESC的AP活性及Oct4表达
Fig4miR-196a-5psuppressedAPactivityandOct4expressionofmESCs(×40)

3 讨论

MicroRNA对ES细胞状态的维持发挥着重要调控作用，现已知多种microRNA影响ES细胞的自我更新和分化潜能；目前对以ES特异的细胞周期调节microRNA(ES cell-specific cell cycle regulating microRNA，ESCC miRNA)为代表的促进ES细胞自我更新的microRNA的研究较为广泛[10- 11]，而对于抑制ES细胞自我更新，促进ES细胞分化的microRNA研究相对较少。DGCR8-/-胚胎干细胞因其中不含有任何内源性的miRNA分子，可以作为研究miRNA功能的有利工具，当在DGCR8-/-胚胎干细胞中导入单个microRNA时，无其余microRNA的拮抗或调控影响，从而能快速准确的观察到导入的microRNA引起的功能变化。目前该细胞已广泛应用于研究microRNA分子在胚胎干细胞中的功能[12]。通过在DGCR8-/-胚胎干细胞中重新引入miR- 196a- 5p表达，并通过多种指标检测了miR- 196a- 5p对于ES细胞自我更新的影响，揭示了其在ES细胞自我更新维持中的负调控作用，对于ES细胞分化机制的研究具有积极意义。

本实验结果显示miR- 196a- 5p在mESC中处于一种低表达状态，而在mESC进入分化状态后，其表达便明显上调，而miR- 196a- 5p能够抑制ES细胞的增殖及自我更新，所以miR- 196a- 5p的表达上升则会进一步促使ES细胞脱离自我更新状态，进入分化程序。因此miR- 196a- 5p在分化过程中的表达上调或许是ES细胞进入分化状态所必需的。而miR- 196a- 5p抑制ES细胞自我更新的具体机制及其在ES细胞分化进行中发挥的促进作用还需要进一步研究。

[1] Silva J, Smith A. Capturing pluripotency[J]. Cell, 2008, 132: 532- 536.

[2] Jia W, Chen W, Kang J. The functions of microRNAs and long non-coding RNAs in embryonic and induced pluripotent stem cells[J]. Genomics Proteomics Bioinformatics, 2013, 11:275- 283.

[3] Greve TS, Judson RL, Blelloch R. microRNA control of mouse and human pluripotent stem cell behavior[J]. Annu Rev Cell Dev Biol, 2013, 29:213- 239.

[4] Tay Y, Zhang J, Thomson AMetal. MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation[J]. Nature, 2008, 455: 1124- 1128.

[5] Xu N, Papagiannakopoulos T, Pan G,etal. MicroRNA- 145 regulates OCT4, SOX2, and KLF4 and represses pluripotency in human embryonic stem cells[J]. Cell, 2009, 137: 647- 658.

[6] Subramanyam D, Lamouille S, Judson RL,etal. Multiple targets of miR- 302 and miR- 372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells[J]. Nat Biotechnol, 2011, 29:443- 448.

[7] Wang Y, Medvid R, Melton C,etal. DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal[J]. Nat Genet, 2007, 39:380- 385.

[8] Kanellopoulou C, Muljo SA, Kung AL,etal. Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing[J]. Genes Dev, 2005, 19:489- 501.

[9] Ciaudo C, Servant N, Cognat V,etal. Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation[J]. PLoS genetics, 2009, 5: e1000620.

[10] Wang Y, Baskerville S, Shenoy A,etal. Embryonic stem cell-specific microRNAs regulate the G1-S transition and promote rapid proliferation[J]. Nat Genet, 2008, 40:1478- 1483.

[11] Anokye-Danso F, Trivedi CM, Juhr D,etal. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency[J]. Cell Stem Cell, 2011, 8:376- 388.

[12] Melton C, Judson RL, Blelloch R. Opposing microRNA families regulate self-renewal in mouse embryonic stem cells[J]. Nature, 2010, 463:621- 626.