Shh促进BMP9诱导的小鼠间充质干细胞C3H10T1/2的成骨分化

李 丽，董 谦，冯巧灵，王玉凤，何通川，罗进勇

(重庆医科大学 检验医学院 检验医学教育部重点实验室 重庆市重点实验室， 重庆 400016)

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有极强的增殖能力和多向分化潜能，常作为种子细胞修复、重建受伤或发生病变的多种组织器官，目前在骨再生研究中应用广泛[1- 2]。

MSCs在定向成骨分化过程中受多种细胞因子调控，其中骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)家族发挥了重要作用。BMPs属于转化生长因子β(transform growth factor-β，TGF-β)超家族成员之一，目前已分离和鉴定出20余种，其中BMP2和BMP7已应用于临床[1,3]。本实验前期研究发现：BMP2-BMP15中，BMP9诱导MSCs成骨分化的能力最强[3]。

Shh是由SHH (Sonic Hedgehog)编码的一种分泌型糖蛋白，可与细胞膜上跨膜受体Patched结合活化另一跨膜受体Smoothened，进而调控细胞内Gli转录因子的活性而激活SHH信号通路。有研究报道在脊椎动物的生长过程中BMP2和BMP4可与SHH共同调控骨骼的形成[4- 5]。然而对于Shh是否可以调控BMP9诱导的MSCs成骨分化的作用目前并不清楚。因此，本研究旨在观察Shh对BMP9诱导MSCs成骨分化的影响，并初步探讨其可能存在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

腺病毒Ad-Shh和Ad-RFP(本实验室构建)，Ad-BMP9和p12SBE-luc(芝加哥大学医学中心何通川教授惠赠)；C3H10T1/2和HCT116 细胞(本实验室保存)；DMEM高糖培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，ALP定量检测试剂盒(BD公司)；Naphthol AS-MX 碱性磷酸酶溶液、Fast Blue RR Salt、茜素红S、β-磷酸甘油和维生素C(Sigma公司)；Lipofectamin2000TM(Invitrogen公司)；荧光素酶检测试剂盒(Promega公司)；PCR引物(上海百力格公司)；一抗β-actin、OPN、OCN、Runx2、DLX5、BMP9和总Smad1/5/8(Santa Cruz公司)，一抗Phosphor-Smad1/5/8(Cell Signaling公司)；其他试剂为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：C3H10T1/2和HCT116细胞用含10%胎牛血清和100 mmol/L的青霉素以及100 g/L的链霉素的DMEM高糖培养基培养于37 ℃，含5% CO2的细胞培养箱。

1.2.2 条件培养基的制备：接种HCT116细胞于60 mm的细胞培养皿中，待细胞汇合至70%～80%时感染适当滴度的Ad-BMP9，4～6 h后换为无血清无双抗的DMEM高糖培养基培养，分别收集24和48 h的上清液[6]。

1.2.3 C3H10T1/2细胞的分化诱导：将C3H10T1/2细胞接种于24孔板中，待细胞汇合至30%～40%时加入适当滴度的 Ad-Shh或Ad-RFP，24 h后加入BMP9条件培养基，培养适当时间进行ALP和钙盐沉积实验(钙盐诱导时需加入50 mg/L的维生素C和10 mmol/L的β-磷酸甘油)。

1.2.4 ALP活性的测定和染色：C3H10T1/2细胞成骨分化诱导5或7 d，弃去培养基，加入裂解液后离心取上清，按试剂盒说明进行ALP活性测定。弃去培养基后加入0.1 g/L色酚AS-MX(Naphthol AS-MX)碱性磷酸酶溶液和0.6 g/L 固牢蓝(Fast Blue RR Salt)混合液200 μL进行ALP染色，避光30 min后观察染色结果。

1.2.5 钙盐沉积实验：C3H10T1/2细胞成骨分化诱导14 d后弃去培养基，PBS清洗两次，每孔加入0.4%的戊二醛固定10 min后双蒸水(ddH2O)终止并加入0.4%茜素红S染液300 μL，待出现红色钙盐物质沉积时弃去染液，ddH2O终止反应并洗涤，在显微镜下观察钙盐结节并成像。

1.2.6 荧光素酶活性的检测：C3H10T1/2细胞接种于T25细胞培养瓶中，待细胞汇合至30%时换为无血清无双抗的改良Eagle培养基(DMEM高糖培养基)，同时用Lipofectamin2000TM转染p12SBE-luc质粒3 μg，4～6 h后换为新鲜培养基培养过夜，将细胞接种于24孔板中，待贴壁后加入处理因素，分别检测24和36 h的荧光素酶活性。

1.2.7 RT-PCR：C3H10T1/2细胞接种于60 mm的细胞培养皿中，待细胞汇合至50%时加入处理因素，在所需时间点提取细胞RNA，反转录反应制备成cDNA，小鼠GAPDH基因作为内参照，RT-PCR检测基因表达。引物序列见表1。

1.2.8 Western blot：C3H10T1/2细胞接种于60 mm的细胞培养皿中，加入处理因素后在所需时间点提取细胞总蛋白，按步骤进行Western blot检测。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 The sequence of primers for RT-PCR

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Shh不影响C3H10T1/2细胞中内源性BMP9的表达

Ad-Shh感染C3H10T1/2细胞(图1A)，感染24 h时Shh的mRNA表达量增加(P<0.05)(图1B)，48 h时，内源性BMP9的mRNA及蛋白的表达无明显变化(图1C，D)。

2.2 Shh促进了BMP9诱导的C3H10T1/2细胞早期成骨分化

5和7 d时，Shh促进了BMP9诱导的早期成骨指标ALP的活性(P<0.05)(图2A)，ALP染色明显增强(图2B)。

2.3 Shh促进了BMP9诱导的C3H10T1/2细胞晚期成骨分化

14 d时，Shh促进了BMP9诱导的晚期成骨指标钙盐沉积(图3A)。Shh促进了BMP9诱导的晚期成骨指标OPN和OCN的mRNA(9 d)及蛋白(11 d)的表达(P<0.05)(图3B，C)。

2.4 Shh促进了BMP9诱导的成骨相关基因的表达

1和3 d时，Shh增强了BMP9诱导的Id1、Id2、Id3、Runx2和CTGF的mRNA水平(P<0.05)(图4A)。48 h时，Shh可增强BMP9诱导的Runx2及DLX5的蛋白表达(P<0.05)(图4B，C)。

2.5 Shh对BMP9诱导的经典Smad信号通路的影响

Shh使BMP9诱导的荧光素酶活性增强(P<0.05)(图5A)。30min时，Shh并未影响BMP9诱导的Smad1/5/8的磷酸化(图5B)。

3 讨论

本实验前期研究发现BMP9诱导MSCs成骨分化的能力最强[3]。大量研究表明，经典Smad、核受体PPARγ、经典Wnt/β-catenin、Notch和TGF-β等信号通路在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中都发挥着重要作用， 形成复杂的信号传导网络[7- 8]。有研究报道SHH也可调控成骨分化和骨形成[4- 5]，但具体作用并不清楚。所以本实验主要研究Shh是否可调控BMP9诱导的MSCs成骨分化。

A.Ad-Shh can infect C3H10T1/2 cells(×100); B.expression of Shh detected by RT-PCR,*P<0.05 compared with Ad-RFP group; C, D.endogenous expression of BMP9 detected by RT-PCR and Western blot

图1Shh不改变内源性BMP9的表达
Fig1ShhdonotchangeendogenousexpressionofBMP9

A.ALP activity determined by ALP quantitative assay, *P<0.05 compared with RFP+BMP9 group; B.ALP staining assay 图2 Shh促进BMP9诱导的C3H10T1/2细胞早期成骨分化Fig 2 Shh enhances BMP9-induced early osteogenic differentiation of C3H10T1/2 cells

A.calcium depositon detected by Alizarin Red S(×100); B, C.expressions of OPN and OCN detected by RT-PCR and Western blot,*P<0.05 compared with BMP9 group

图3Shh促进BMP9诱导的C3H10T1/2细胞晚期成骨分化
Fig3ShhenhancesBMP9-inducedlaterosteogenicdifferentiationofC3H10T1/2cells

实验发现Shh促进了BMP9 诱导的C3H10T1/2细胞的早期成骨指标ALP和晚期成骨指标OPN、OCN的表达以及钙盐沉积，也促进了BMP9 诱导的成骨相关基因Id1、Id2、Id3、CTGF、DLX5和Runx2的表达。质粒p12SBE-luc在报告基因前插入了12个连续的Smad蛋白结合元件(Smad binding element，SBE)， Smad经典途径激活后可启动荧光素酶的表达[6]。观察机制时发现Shh增强了BMP9诱导的Smad的荧光素酶活性，但并未改变其磷酸化水平，这可能是由于SHH下游转录因子Gli直接作用于Smad所致。因此后续将通过IP实验检测Gli与Smad之间的作用。

A.expressions of Id1, Id2, Id3, Runx2 and CTGF detected by RT-PCR,*P<0.05 compared with BMP9 group; B,C.expressions of Runx2 and DLX5 detected by Western blot,*P<0.05 compared with BMP9 group

图4Shh促进BMP9诱导的成骨相关基因的表达
Fig4ShhenhancesBMP9-inducedexpressionofosteogenesisrelatedgenes

A.SBE luciferase activity detected at 24 and 36 hours,*P<0.05 compared with BMP9 group; B.Shh did not change the phosphorylated form of Smad1/5/8 determined by Western blot

图5Shh对BMP9诱导的经典Smad信号通路的影响
Fig5EffectofShhonBMP9-inducedactivationofcanonicalSmadpathway

有研究报道Hedgehog信号通路可通过Gli2调控成骨关键转录因子Runx2的表达从而调节成骨分化[9]，接下来将通过染色质免疫共沉淀实验探讨Gli与BMP9下游成骨基因之间的关系。另外，还将构建Shh和Gli的干扰腺病毒，通过体内外实验对Shh调控BMP9诱导的MSCs成骨分化的作用及其机制进行更深入的分析。

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