硅基质膜吸附柱对质粒DNA再吸附能力的研究

刘传青，向玲娟，黄 娟，陈孝平

（武汉工程大学化工与制药学院 绿色化工过程省部共建教育部重点实验室，湖北 武汉430074）

随着人们对质粒提取的浓度和纯度的要求越来越高，传统的质粒提取技术因费时长、提取效率低［1－2］亟待改进，硅基质膜吸附柱（离心柱型）质粒提取试剂盒的出现，正好解决了这一问题。硅基质吸附材料可特异性吸附核酸DNA，使用方便、快捷，不需用有毒溶剂如苯酚、氯仿等，使得提取基因组DNA像过滤一样简单，其原理为：在pH值等于或低于硅基质材料表面pKa值的高离子浓度缓冲溶液中，硅基质材料表面负电荷减少，DNA分子所带负电荷与其表面的斥力减小，水合程度降低，被吸附到硅基质材料表面上［3－4］，与此同时，DNA分子与硅基质材料表面的羟基形成氢键，氢键力远大于静电斥力，DNA分子将牢牢吸附在硅基质材料表面［5－7］；再用pH值高于pKa值的低离子浓度的缓冲溶液洗脱吸附在硅基质材料表面的DNA分子，破坏其间的氢键，即可达到提取目的［8－9］。因此，硅基质膜材料吸附质粒已成为大规模分离纯化DNA，去除蛋白、多糖、盐类和有机溶剂等杂质的通用方法［10－11］。随着生物学大通量实验的出现，对商品化核酸提取试剂盒的需求量明显增加，而且商品化的吸附柱大都是一次性的。根据硅基质膜材料作用原理推测通过某些溶液的处理，能恢复其吸附能力。作者在此探究了商品化质粒提取试剂盒中吸附柱重复利用的可能性，拟为降低分子生物学实验成本提供参考。

1 实验

1.1 试剂与仪器

含pcDNA3.1－6His－Thioredoxin－1质粒大肠杆菌菌株，自行保存；质粒提取试剂盒，碧云天公司；PBS缓冲溶液、大批量质粒提取试剂，自行配制；1kb DNA ladder、XhoⅠ限制性内切酶，Takara公司。

台式恒温振荡器，太仓实验仪器厂；DYY－10C型电泳仪，北京六一仪器厂；HC－3018R型高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；暗箱式紫外分析仪，上海嘉鹏科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pcDNA3.1－6His－Thioredoxin－1质粒水溶液的制备

挑取含pcDNA3.1－6His－Thioredoxin－1质粒单菌落至50mL含氨苄抗生素的LB培养基中，37℃、180 r·min－1下振荡培养12～16h。用大批量质粒提取试剂提取质粒，用水保存质粒。

1.2.2 吸附柱的处理

1）不同溶液

取3支吸附柱各加200μL质粒水溶液过柱，用100μL洗脱液反复洗脱3次尽可能除去吸附柱上吸附的质粒。将第1次过柱回收的质粒于－20℃保存。将吸附柱分别置于离子浓度为0.01mol·L－1、pH值为7.01的PBS缓冲溶液、75%酒精溶液和双蒸水中，于4℃保存3d和6d后取出，重新加入200μL质粒水溶液，用100μL洗脱液洗脱，回收的质粒与第1次过柱回收质粒一起用XhoⅠ单酶切进行琼脂糖凝胶电泳，比较不同溶液的处理效果。

2）pH值

配制不同pH值的PBS缓冲溶液（表1）。将质粒水溶液第1次过柱后回收的质粒于－20℃保存。将吸附柱编号对应放入编号烧杯中，于4℃保存6d后取出，重新加质粒水溶液再次过柱，回收的质粒与第1次过柱回收质粒一起用XhoⅠ单酶切进行琼脂糖凝胶电泳，比较不同pH值时的处理效果。

表1 不同pH值的PBS缓冲溶液Tab.1 PBS Buffers with different pH values

3）离子浓度

配制不同离子浓度的PBS缓冲溶液（表2）。将质粒水溶液第1次过柱后回收的质粒于－20℃保存。将吸附柱编号对应放入编号烧杯中，于4℃保存6d后取出吸附柱，重新加质粒水溶液再次过柱，回收的质粒与第1次过柱回收质粒一起用XhoⅠ单酶切进行琼脂糖凝胶电泳，比较不同离子浓度下的处理效果。

表2 不同离子浓度的PBS缓冲溶液Tab.2 PBS Buffers with different ion concentrations

4）温度

将质粒水溶液第1次过柱后回收的质粒于－20℃保存。将吸附柱放入离子浓度为0.01mol·L－1、pH值为2.04的PBS缓冲溶液中，分别于常温、4℃和－20℃保存6d后取出，重新加质粒水溶液再次过柱，回收的质粒与第1次过柱回收质粒一起用XhoⅠ单酶切进行琼脂糖凝胶电泳，比较不同温度下的处理效果。

2 结果与讨论

2.1 不同溶液处理效果

由于质粒存在多种形式，电泳时无法集中在同一条带进行分析，为了更好地比较质粒回收的效率，将经过不同溶液处理的吸附柱所回收的质粒，各取10μL用XhoⅠ限制性内切酶进行酶切，琼脂糖凝胶电泳分析如图1所示。

图1 不同溶液处理效果Fig.1 The effects treated by different solutions

从图1可以看出：水处理在短期内（3d）可以恢复吸附柱一定的再吸附能力，随着时间的延长吸附柱的再吸附能力越来越弱；0.01mol·L－1PBS缓冲溶液和75%酒精溶液处理都可以恢复吸附柱一定的再吸附能力，并且0.01mol·L－1PBS缓冲溶液处理的吸附柱的再吸附能力要强于75%酒精溶液处理的，且其再吸附能力比吸附柱第1次吸附能力有所增强。用0.01mol·L－1PBS缓冲溶液处理吸附柱6d，吸附柱再吸附能力恢复效果最好。故选用0.01mol·L－1PBS缓冲溶液处理吸附柱。

2.2 pH值对吸附柱吸附能力的影响

将不同pH值的0.01mol·L－1PBS缓冲溶液处理的吸附柱回收的质粒，各取10μL用XhoⅠ限制性内切酶进行酶切，琼脂糖凝胶电泳分析如图2所示。

图2 pH值对吸附柱吸附能力的影响Fig.2 The effect of pH value on adsorbability of adsorption column

从图2可以看出：pH值对吸附柱再吸附能力影响很大；低pH值有利于吸附柱恢复再吸附能力。这是因为，经过低pH值溶液处理的吸附柱硅基质膜表面负电荷减少，DNA分子带有的负电荷与硅基质膜之间的斥力减小，有利于吸附柱吸附DNA分子［6］。实验组吸附柱经pH值2.04的PBS缓冲溶液处理后，对DNA分子表现出较好的吸附效果，表明其恢复了较高的再吸附能力。故选用pH＝2.04的PBS缓冲溶液处理吸附柱。

2.3 离子浓度对吸附柱吸附能力的影响

将不同离子浓度、pH值为2.04的PBS缓冲溶液处理的吸附柱回收的质粒，各取10μL用XhoⅠ限制性内切酶进行酶切，琼脂糖凝胶电泳分析如图3所示。

图3 离子浓度对吸附柱吸附能力的影响Fig.3 The effect of ion concentration on adsorbability of adsorption column

从图3可以看出：离子浓度对吸附柱的再吸附能力影响不明显；较高的离子浓度反而对吸附柱的再吸附能力有抑制作用。实验组只用了不同离子浓度的溶液处理吸附柱，还应该增加对DNA分子样品离子浓度的考察。因为高离子浓度的DNA分子样品可以有效地降低DNA分子的水合度从而更好地驱使DNA分子与吸附柱硅基质膜的结合［6］。用离子浓度为0.01mol·L－1的PBS缓冲溶液处理吸附柱，可以使其恢复较高的再吸附能力。故选用离子浓度为0.01mol·L－1、pH值为2.04的PBS缓冲溶液处理吸附柱。

2.4 温度对吸附柱吸附能力的影响

将经过不同温度处理的吸附柱回收的质粒，各取10μL用XhoⅠ限制性内切酶进行酶切，琼脂糖凝胶电泳分析如图4所示。

图4 温度对吸附柱吸附能力的影响Fig.4 The effect of temperature on adsorbability of adsorption column

从图4可以看出：较低的温度有利于吸附柱再吸附能力的恢复，最佳温度为4℃。

2.5 讨论

实验中发现，经过处理的吸附柱的再吸附能力相对于吸附柱第1次吸附能力有所增强，可能是吸附柱在较低温度的低盐高pH值的溶液中保存要比在空气中保存更有利于提高其吸附能力，这为提高商品化质粒提取试剂盒回收质粒的浓度提供了一定的理论基础。

3 结论

为了更好地降低生物学实验成本，对市场上质粒提取试剂盒中吸附柱可重复利用性进行了初步研究。探讨了不同溶液、保存时间、pH值、离子浓度以及温度对恢复吸附柱再吸附能力的影响。结果表明：使用后的吸附柱经过一定的处理可以有效地恢复其对质粒DNA的再吸附能力。确定最佳处理条件为：在离子浓度为0.01mol·L－1、pH值为2.04的PBS缓冲溶液中于4℃保存6d。经过处理，吸附柱的再吸附能力相对于其第1次吸附能力有所增强。

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