昆虫抗菌肽的作用机制与应用研究进展

Osama A O Elhag，宋 旗，郑龙玉，喻子牛，张吉斌

（1.华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室 微生物农药国家工程研究中心，湖北 武汉430070；2.Department of Biotechnology－Sc.＆Tech－Omdurman Islamic University，Sudan）

昆虫是动物世界种类数目最庞大的一类。目前，除了极地和深海，昆虫能在大多数的生物生境被发现。超过一百万的昆虫物种已被鉴定，且约有同等数量的种类仍有待确定。昆虫的抵抗病原体能力必然有助于其大量增殖和多样性。昆虫的免疫系统具有一些共同的特点，没有发现类似于高等动物中的特异性免疫系统。由于缺乏B和T淋巴细胞以及无免疫球蛋白和补体，使得昆虫进化出有效和复杂的先天免疫系统，这明显不同于脊椎动物的适应性免疫系统。昆虫抗菌肽（AMPs）是昆虫免疫系统的一个关键部分，主要由脂肪体合成，其功能类似于哺乳动物的肝脏［1］。

抗菌肽的生物学功能包括抗细菌、抗真菌、抗寄生虫、抗肿瘤和抗病毒活性等。作为先天免疫系统的抗感染的重要组成成分，从自然界的昆虫和植物到高度进化的有更复杂免疫系统的动物，均广泛表达抗菌肽［2］。到目前为止，已有成百上千的抗菌肽被报道，它们中的大多数来自不同的有机体，但具有共同的性质，如分子量小、带正电荷、在疏水性的环境中具两亲性等。抗菌肽大致可基于共同的二级结构模体分为5组：两亲性含α螺旋的肽、分子内有二硫键的肽、溶解酵素的肽、富含甘氨酸的肽和富含脯氨酸的肽［3］。来源于昆虫的抗菌肽通常是带阳离子的，一般少于100个氨基酸。从不同昆虫分离的抗菌肽的分类取决于它们的同族性，主要有cecropins、attacins、lysozymes、defencins和dipteracins［4］。Boman团队从罗宾蛾（Hyalophora cecropia）免疫性蛹的血淋巴纯化出第一个抗菌肽。研究者已从双翅目昆虫分离出了5个类型的抗菌肽，从果蝇中分离出的7个不同类型的抗菌肽（包括cecropins、drosocin、attacins、dipteracins、defensin、drosomycin和metchnikowins）已通过全基因组微阵列分析鉴定和表征［4］。

抗菌肽的作用机制是非常复杂的，包括破坏细胞膜、作用细胞质成分与干扰代谢［5］等。作者在此对已发现的昆虫抗菌肽的作用机制及其应用进行了综述。

1 作用机制

目前，研究已证实抗菌肽可通过与微生物阴离子表面的相互作用和插入到磷脂组成的细胞膜来发挥作用。这一作用导致对细胞膜完整性的破坏，如去极化和孔隙的形成。此外，最近报道某些昆虫抗菌肽通过不同的机制产生抗菌活性，包括对细胞呼吸的抑制、细胞壁形成的抑制、细菌蛋白失活和诱导酵母凋亡。

1.1 破坏细胞膜的机制

阳离子抗菌肽与磷脂结合时，抗菌肽与细胞膜的相互作用开始。当抗菌肽与脂质的比例较低时，与阳离子抗菌肽相关联，多肽将平行于膜的平面，插入在亲水脂质头部基团和疏水脂肪链的界面。然而，随着肽脂比的增大，这些多肽能够在细胞膜聚集或重新定位而破坏其完整性。这通常通过3个假设的模型之一来实现：筒壁模型、地毯模型和环形孔模型。在筒壁模型中，许多螺旋肽单体联合形成孔隙造成膜的破坏；在地毯模型中，肽结合在膜表面并通过形成环形孔而破坏膜结构；在环形孔模型中，肽与膜脂质头部基团结合引起膜的减薄［6］。

透射电子显微观察发现，昆虫防御素（defensin）对革兰氏阳性菌藤黄微球菌（Micrococcus luteus）的作用导致了胞质膜被溶解和细胞质内含物的泄漏。表明defensin作用的基本机制是细菌胞膜溶解［7］。来自伏蝇（Phormia terranova）幼虫血液的重组昆虫defensin对藤黄微球菌的作用机制已被阐明。结果表明，防御素造成细胞质钾的损失、部分内膜去极化、细胞质ATP减少和呼吸抑制，这主要由于电压依赖性通道的形成导致细菌细胞质膜的通透性发生改变［8］。van den Bogaart等［9］研究发现，蜂毒素引起由两性离子二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）脂质组成的脂质体的两种效应：其一，肽－孔隙形成导致囊泡内含物的泄漏；其二，当蜂毒肽附着在非活性构象的膜表面时保护膜免受泄漏，从而防止其它蜂毒肽分子插入到双分子层。细胞壁溶解酶是受感染的鳞翅目昆虫溶菌酶，该酶可水解细菌细胞的肽聚糖层中的N－乙酰葡糖胺和N－乙酰胞壁酸残基的β－1，4－糖苷键，并引起细胞溶解［4］。

抗菌肽attacins通过抑制外膜蛋白合成活性来抑制革兰氏阴性菌，而抗菌肽moricin通过增加细胞膜的通透性来杀死革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌［4］。Wang等［10］研究显示，从黄蜂（Polybia paulista）的毒液中分离纯化得到的抗菌肽polybia－MPI的作用靶标是细菌的膜，通过破坏膜的完整性，最终导致细胞内含物渗漏。此外，对polybia－MPI与DNA结合特性的研究表明，它没有与DNA结合，证实polybia－MPI是以细胞膜为目标发挥其抗菌活性。

某些抗菌肽通过改变细胞膜的完整性杀灭真菌，如cecropins，其在杀菌剂量下没有表现对哺乳动物细胞的毒性，已被证明对动物安全［11］。白蚁（Pseudacanthotermes spiniger）产生的抗菌肽spinigerin的作用模式与非洲爪蟾产生的抗菌肽magainin 2相似，是通过增加膜通透性来抗菌的［12］。

1.2 非膜破坏性的机制

虽然大多数昆虫抗菌肽与细胞膜相互作用并影响细胞膜的完整性，但膜通透性增加是否是主要的致死因素或细胞膜是否是唯一作用部位尚不清楚。有许多抗菌肽采用不同的非膜破坏性的作用模式。昆虫产生的麻蝇素－Ⅱ（sarcotoxinsⅡ）和β－defensin－3均能抑制细胞壁生成，以阻止细菌正常细胞形态的形成，但对已经存在的细胞壁没有作用［13］。昆虫类抗菌肽如pyrrhocoricin、apidaecin和drosocin，被认为是通过进入细胞内抑制分子伴侣DnaK生成来杀死细菌。Otvos等提出L－pyrrhocoricin（L－PYR）结合到DnaK上的非传统的结合位点，也就是αE和αD螺旋多层螺旋盖的亚结构域，并且L－PYR阻止了DnaK的盖子打开和关闭［14］。

刺盲椿（Podisus maculiventris）产生的抗菌肽thanatin不改变细菌膜的通透性，而是导致细菌细胞的凝集。这种抗菌肽的D－对映异构体不具有抗细菌活性，但仍然具有抗真菌活性［12］。研究表明，抗菌肽thanatin杀死细菌是通过抑制细胞呼吸，而不是影响细胞膜，当以不同浓度的thanatin处理细菌细胞时，没有检测到K＋向外流动，这一现象表明细胞膜不是该抗菌肽的靶标。而增加thanatin浓度（40μmol·L－1），处理1h后，能减弱细胞呼吸，6h后呼吸完全停止［5］。

抗菌肽天蚕素A对大肠杆菌的非致死性影响是通过对其细胞内少数基因转录水平的改变实现的［15］。attacins通过干扰外膜蛋白基因的转录，从而减少这些蛋白质的含量，增加细胞膜的通透性，最终抑制细菌的生长［5］。DNA作为遗传信息的载体，在生理过程中起着重要的作用。抗菌肽与DNA的相互作用引起了研究者的关注。研究发现，某些昆虫抗菌肽能与细菌的DNA结合，影响其正常的生理功能。如家蚕抗菌肽cecropin能够结合质粒pECP1DNA，凝胶迁移率变动分析表明其迁移率受到影响［5］。

2 抗菌肽的应用

目前，由于抗生素的过度使用导致了许多耐药菌的产生［16］，而多种抗生素耐药的细菌病原体可被昆虫抗菌肽拮抗［17］，因而对有效的抗菌肽药物的需求大量增加。抗菌肽作为常规抗生素新的替代品［5］具有许多理想的特性，如生产成本低、作用速度快、耐高温、抗菌谱较广、对真核细胞的毒性低等，可以不同的方式作为抗菌剂或治疗剂发挥作用：可用作单一的抗菌剂；可结合其它抗菌剂提高抗菌活性；能够增强病人的免疫系统；可作为感染性休克内毒素的中和剂。到目前为止，AMPs作为单独的抗菌剂使用最受关注，作为经典抗生素治疗的辅助物和内毒素中和剂也得到较多研究。

天蚕素（cecropins）是最初发现产自天蚕蛾的多肽，主要对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌［4］以及真菌有抗菌活性，当cecropins使用量在25～100μg·mL－1时无法拮抗病原性的曲霉菌病。串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）对cecropin A特别敏感，浓度为12.4μg·mL－1时可以完全杀灭［11］。昆虫防御素对革兰氏阳性菌有很高的活性，但对革兰氏阴性菌的拮抗活性不高［5］。

果蝇产生的一种防御素drosomycin和从十字花科种子纯化得到的抗真菌肽相似，其在结构上类似于萝卜抗真菌肽Rs－AFP1，主要对尖孢镰刀菌菌株起作用［11］。Yamada等研究表明，从日本甲虫分离得到的防御素对抗生素甲氧西林有抗药性的金黄葡萄球菌菌株有拮抗活性。D2A21是cecropins的模拟肽，对感染创面的治疗比标准治疗更加有效，接受D2A21治疗的大鼠长期生存率达100%，而对照组只有50%［4］。从昆虫提取的抗真菌肽包括thanatin和holotricin 3。富含组氨酸的抗真菌肽导致细胞内含物泄漏。这些抗真菌肽是从肉蝇（Sarcophagaperegrina）的第三龄幼虫血淋巴中分离得到的，体外实验证实其对白色念珠菌（Candida albicans）有拮抗作用。斑腹刺益蝽（Podisus maculiventris）产生的抗菌肽thanatin能有效抑制尖孢镰刀菌（F.oxysporum）和烟曲霉（Aspergaillus fumigatus）而无溶血作用。从东北大黑鳃金龟（Holotrichia diomphalia）幼虫的血淋巴纯化得到一种富含甘氨酸和组氨酸的肽holotricin 3，能抑制白色念珠菌的生长［11］。

Chernysh等［18］研究表明，从红头丽蝇（Calliphora vicina）中分离的抗菌肽alloferons可与流感病毒血凝素蛋白进行竞争，干扰病毒组装甚至阻止病毒吸附于细胞，从而降低感染流感病毒小鼠的死亡率。研究者通过改变蜂毒肽电荷的分布情况得到了1个非常成功的蜂毒肽衍生物Hecate，保持了其三维结构。Hecate表现出抗单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV－1）的效果，可以在相对较低的浓度下减少血小板的形成，但不干扰病毒的蛋白合成过程。据报道，Hecate能阻止HSV－1诱导的细胞融合和病毒的传播［19］。

研究证明抗菌肽cecropin通过抑制艾滋病毒HIV－1基因的活性或降低病毒基因转录水平，能减少HIV－1对细胞的进一步感染。来自于甲虫（Allomyrina dichotoma）的抗菌肽defensin的人工衍生物有抗菌和抗炎活性。抗菌肽能阻止脂多糖（LPS）与位于巨噬细胞表面上的受体进行相互作用，也可阻止α－肿瘤坏死因子（TNF－α）的产生［3］。从红头丽蝇分离的低分子量的抗菌肽alloferon可刺激小鼠产生干扰素以及激发小鼠脾淋巴细胞的细胞毒性作用［18］。

半翅目昆虫产生的抗菌肽thanatin对多药耐药的肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌有高效抑制作用。这些菌株能够通过改变细胞膜的通透性抵抗不同结构抗生素的效果。thanatin通过改变细菌细胞膜对抗生素的通透性或迫使细菌形成具有特殊结构的细胞膜，从而增强抗生素对这些耐药株的作用。细菌和肿瘤细胞膜的共同特征是带负电荷［20－21］。由于肿瘤细胞膜含有一定数量带负电荷的磷脂酰丝氨酸，因而比正常细胞多带3%～9%的负电荷［22］。通过转化部分L型氨基酸生成D－对映体得到蜂毒肽衍生物，新的抗菌肽具有高效肿瘤抑制作用而无溶血作用。蜂毒肽类似物Hecate被认为对乳腺癌细胞具有杀伤作用［3］。Hecate通过与激素结合产生共轭Hecate激素来实现有效传播的，其受体如促黄体生成激素位于细胞表面，同时Hecate的细胞选择性也会提高［18］。在异色瓢虫（Harmonia axyridis）产生的像防御素defensin的抗菌肽harmoniasin的人工二聚体肽类似物中，HaA4被发现有很高的抗菌活性且尚未发现溶血活性，还被认为可以作为人白血病的有效治疗剂［23］。

3 结语

随着抗生素在医药、农业和食品工业的广泛使用，多耐药性细菌不断增加，使得传统的抗生素失去效果或效果有限，因此迫切需要开发新的抗生素。天然抗菌肽是先天免疫能迅速应对不同病原微生物的重要元素［2］，具有耐热性好、抗菌谱较宽、对真核细胞毒性低等性能［3］，目前病原对抗菌肽的抗性十分罕见，因而抗菌肽被认为具有替代传统抗生素的前景。昆虫是抗菌肽的重要来源，昆虫抗菌肽可以作为一个潜在的人类和动物药物的重要来源［5］。虽然研究者从不同昆虫中鉴定了大量抗菌肽，但部分昆虫抗菌肽的作用机制还不完全明确，仍需进一步加深加强相关研究，以推进昆虫抗菌肽药物的开发和应用［24－25］。

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