利用木糖发酵生产乙醇的好食脉孢菌选育及其发酵条件优化

洪亚辉，谢伟国，程鹏，李俊

利用木糖发酵生产乙醇的好食脉孢菌选育及其发酵条件优化

洪亚辉1,2，谢伟国1,2，程鹏1,2，李俊1,2

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128；2.湖南农业大学植物激素与生长发育湖南省重点实验室，长沙 410128）

通过高压富集法，从土壤中分离筛选得到一株纤维素降解菌株，并对其木糖发酵特性进行初步研究。根据菌株的形态特性和生理生化特征，初步鉴定为好食脉孢菌（Neurospora sitophila）。结果表明，该菌株CMC酶活力为3 554.88 U·g-1、FPA酶活力为506.76 U·g-1，当紫外线照射剂量30 W，照射距离20 cm，照射时间为8 min时，致死率为77.28%。在木糖浓度20 g·L-1、发酵温度25℃、发酵时间96 h、转速140 r·min-1的条件下乙醇产量可达5.5 g·L-1，乙醇得率为理论值的59.8%。

好食脉孢菌；木糖；发酵；乙醇；紫外诱变

纤维素主要由半纤维素、木质素组成[1]。在半纤维素被降解后，其水解产物中绝大部分是木糖[2]。木糖是除了葡萄糖之外的单糖，因此，筛选良好的发酵菌株是实现发酵产纤维素乙醇的最重要因素。而脉孢菌（Neurospora）同时具有产纤维素酶、木聚糖酶和发酵乙醇所需酶能力，能直接转化纤维素为乙醇[3-4]。本研究旨在寻找新的高效发酵木糖产乙醇野生脉孢菌株，通过分子生物学技术等手段对一株从土壤中分离筛选出的纤维素降解菌株进行菌种种类鉴定，并对其生长特性与发酵特性进行深入研究，找到最佳发酵条件或适宜突变菌株，为木糖利用关键技术研究提供优良菌株资源。

1 材料和方法

1.1 菌株

从湖南农业大学周边农田采集土样分离菌株。

1.2 培养基

PDA固体培养基：马铃薯200 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，琼脂20 g·L-1。

木糖基础培养基[5]：木糖：20 g；蛋白胨：15 g；酵母粉：10 g；NH4SO4：1 g；KH2PO4：1 g；MgSO4·7H2O：0.5 g；CaCl2·2H2O：1 g，H2O：1 000 mL。

纤维素琼脂培养基：琼脂18g，纤维素20g，蛋白胨：15 g；酵母粉：10 g；NH4SO4：1 g；KH2PO4：1 g；MgSO4·7H2O：0.5 g；CaCl2·2H2O：1 g，H2O： 1 000 mL。

纤维素产酶培养基：KH2PO4：1 g，FeCl3：0.01 g，MgSO4·7H2O：0.3 g，NaNO3：2.5 g，CaCl2：0.1 g，NaCl：0.1 g，H2O：1 000 mL，pH 7.2～7.4。

1.3 发酵木糖菌株的筛选

称取适量已干燥土壤于5 mL灭菌去离子水中制成菌悬液，混匀后取1～9 mL无菌水中，从稀释十倍的菌悬液中取1～9 mL无菌水中再稀释十倍，将菌悬液稀释至10-5，再用纤维素琼脂培养基在30℃恒温条件下筛选，将筛选菌株统一编号。在30℃、120 r·min-1条件下，摇瓶发酵48 h，筛选乙醇得率较高菌株。

1.4 菌株的鉴定

1.4.1 菌株的形态特征

挑取少量筛选的菌体，涂布在PDA培养基上，观察菌落形态，主要包括菌落的形状、颜色、湿润情况、隆起形状、边缘整齐情况等方面。菌落的个体形态特征在JSM-6380LV扫描电子显微镜下观察[6]。

1.4.2 菌株的生理生化特征

碳源同化：选用硫酸铵作为氮源，测试其碳源的同化能力，包括Galactose、Sucrose、Ethanol、Sorbose、Citric acid、Mannitol。糖发酵：选用硫酸铵—氮源，测试其糖类的发酵能力，包括Soluble starch、Glucose、Sucrose、Lactose、Xylose。氮源同化：选用葡萄糖—碳源，测试其碳源的同化能力，包括Potassium nitra、Ammonium sulfate。以上3组试验都在120 r·min-1、30℃下恒温培养。

1.4.3 分子鉴定

用SDS法提取目的菌株的总DNA后，采用ITS通用引物（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）进行PCR扩增。PCR扩增条件：95℃3 min；94℃1 min，54℃45 s，72℃45 s，35 Cycles；72℃10 min。4℃保存。测序得到的ITS序列利用Clustal X、MEGA4.1等第三方软件构建系统发育树[7]。结合形态生理生化特征的检测结果以及ITS分析确定所得菌株的种属关系。

1.4.4 滤纸酶活力（FPA）与羟甲基纤维素酶活力（CMCA-DNS）的测定

纤维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物（滤纸或CMC-Na）水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，3，5-二硝基水杨酸（DNS试剂）与还原糖发生显色反应，其颜色深浅与还原糖（葡萄糖）含量成正比。通过在540 nm测其吸光度，可得到产生还原糖量，计算出纤维素酶的滤纸酶活力。

①粗酶液的制备

取培养7 d的发酵液，于4℃、3 000 r·min-1离心15 min，取上清液，即为粗酶液。

②标准曲线的绘制与滤纸酶活力（FPA）测定

定义每分钟催化纤维素水解生成1 μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位（IU），其计算公式为：

式中，X1-样品的滤纸酶活力（FPA），（U·g-1或 U·mL-1）；X2-羟甲基纤维素酶活力（CMCA-DNS），（U·g-1或U·mL-1）；A-根据吸光度在标准曲线上差得（或计算出）还原糖量（mg）；1/0.5-换算成酶液1 mL；n-酶样的稀释倍数；2-时间换算系数。

1.5 菌株的紫外诱变与筛选

将用生理盐水制备好的孢子悬液放置于30 W紫外灯下距离20 cm处进行诱变，诱变时间跨度为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 min。到达照射时间后，用移液枪吸取0.1 mL并稀释涂平板，每个照射时间依次稀释到104·mL-1、103·mL-1、102·mL-1，每个梯度吸取0.1 mL涂在纤维素琼脂平板上，每个稀释度做2个平行试验组，计数时取两者的平均数。在避光，29℃条件下倒置培养。1～2 d后挑取长势较好的单菌落接斜面培养，用于进一步筛选。

1.6 菌株发酵木糖工艺条件优化

1.6.1 菌株生长曲线的绘制

在30℃、120 r·min-1的恒温摇床上培养24 h，每隔4 h取一次样品，测定乙醇浓度、残糖浓度及其菌体的干重，构建筛选菌株的生长曲线。

1.6.2 发酵条件的优化

发酵培养中设置不同的木糖浓度（10、15、20、25、30 g·L-1），不同的发酵温度（25、30、35、40、45℃），不同的发酵时间（24、48、72、96、120 h），不同的摇床转速（100、120、140、160、180 r·min-1）。根据摸索得到最合适的木糖浓度、发酵温度、发酵时间和摇床转速来设计影响因子的水平，采用四因素三水平的正交优化试验（见表1），以乙醇的浓度为考察指标，确定发酵最佳条件。

表1 正交试验设计Table 1 Table of orthogonal experimental design

2 结果与分析

2.1 发酵木糖菌株筛选与滤纸酶活力（FPA）测定

根据纤维素琼脂培养基表面上纤维素水解透明圈大小及其相应菌株的木糖利用率和乙醇产率，筛选到5株产乙醇能力较强的菌株，将其分别编号为X1、X2、X3、X4、X5。

由表2可知，X4号菌株的乙醇产量和乙醇得率最高，发酵20 g·L-1木糖产乙醇含量为5.05 g·L-1，乙醇得率接近理论值的54.89%，并命名X4菌株为YYH101。YYH101经过滤纸酶活力测定，其CMC酶活力3 554.88 U·g-1、FPA酶活力506.76 U·g-1，且其活力稳定性好。

2.2 菌株的鉴定

2.2.1 菌株的形态特征鉴定

菌株YYH101首先呈白色透明树状匍匐菌丝，待气生菌丝长出来后，呈白色绒毛状见图1。菌丝表现为匍匐生长趋势，菌落透明且多横隔[7]。最终气生菌丝转变为橘黄色分生孢子，分子孢子多为卵圆形，成熟后多以团块形式聚集，扫描电子显微镜下可见孢子表面有皱摺（见图2）。

2.2.2 菌株的生理生化特征鉴定

筛选菌株YYH101的生理生化同化试验结果详见表3。

对照参考文献[8]生理生化特征，判断菌株YYH101为脉孢菌属（Neurospora）。

表2 菌株筛选的发酵试验Table 2 Fermentation test filter of strains

图1 菌株YYH101的形态特征Fig.1 Morphological characteristics of strain YYH101

图2 菌株YYH101的扫描电镜Fig.2 Strian YYH101 under scanning electron microscope

表3 菌株YYH101的生理生化同化试验Table 3 The test of physiological and biochemical assimilation of strain YYH101

2.2.3 分子鉴定

测定筛选菌株YYH101的ITS全长序列，全长为559 bp。该菌株的ITS序列结果在GenBank中进行序列同源性分析，比对结果得知筛选菌株YYH101的ITS序列与登录号为JF911746.1（Neurospora sitophilaQH9）的菌株的亲缘关系最近，同源性达99%。因此，初步判定菌株YYH101为好食脉孢菌（Neurospora sitophila）。

图3 系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree

2.4 菌株的紫外诱变与筛选

由表4和图4可见，在诱变前6 min内时，致死率不明显；6 min时致死率达到50.75%，6 min后致死率随紫外线照射时间延长，孢子死亡率逐渐提高，在8 min时致死率达到77.28%，在9和10 min时，菌体死亡率分别达到85.61%和91.67%，致死效果十分显著。因此，在紫外线照射剂量30 W，照射距离20 cm，照射时间为8 min时，其菌株YYH13正突变率最高。

表4 紫外处理对菌种的致死率Table 4 Fatality rate after ultraviolet radiation

图4 紫外处理对菌种的致死率Fig.4 Fatality rate after ultraviolet radiation

2.3 菌株发酵木糖最适条件优化

2.3.1 菌株的生长曲线

从图5可见，YYH101在48～68 h生长速度较快，处于对数生长期；68 h后由于细胞自溶、底物或溶氧的减少生长速度开始下降，菌体逐步减少并进入衰退期。因此，本研究以最适菌体生长时期进行培养，菌种活化培养的时间为60～68 h。

2.3.2 木糖浓度对乙醇产量的影响

从本试验结果得出，随木糖浓度增加，细胞生长速率逐渐降低，但最终生物量累积并无过大差异。不同木糖浓度下细胞生长呈各方面相似趋势，高浓度木糖条件不存在对细胞生长的抑制作用。初步认为在10～20 g·L-1条件下木糖可以被全部利用，在20 g·L-1时乙醇产量最高，为3.25 g·L-1，乙醇得率为35.32%，其余浓度条件下木糖利用率不高，且木糖浓度越高，其利用率越低。乙醇产量因初始木糖浓度不同而不同，乙醇生成速率随初始木糖浓度升高而降低（如图6）。

图6 木糖浓度对乙醇产量的影响Fig.6 Effect of concentration of xylose on ethanol yield

2.3.3 发酵温度对乙醇产量的影响

从本试验结果表明，菌株YYH101在不同发酵温度条件下产乙醇的产量不同。当发酵温度为30℃时，乙醇产量达2.75 g·L-1，乙醇得率接近理论值的29.89%；当发酵温度在25至35℃时，发酵温度对乙醇产量影响较小；当发酵温度超过35℃，菌体的发酵产乙醇的含量减少15%，初步认为25～35℃为发酵温度的筛选区间。见图7。

2.3.4 发酵时间对乙醇产量的影响

从本试验结果得出，菌株YYH101在不同发酵时间条件下产乙醇的产量不同。当发酵时间为48～96 h时，本试验菌株都能被木糖利用发酵产乙醇。当发酵时间达到72 h时，菌株发酵产乙醇浓度较高，乙醇产量为3.22 g·L-1，乙醇得率为35.4%。因此，初步认为48～96 h为适宜发酵时间（见图8）。

2.3.5 摇床转速对乙醇产量的影响

当转速为160 r·min-1时，乙醇产量5.12 g·L-1达到最高，乙醇得率为理论值的55.6%。当转速小于120 r·min-1时，因菌体基数过小而影响菌体的生长总量，导致乙醇产量明显降低；当转速大于160 r·min-1时，因菌体基数过大而影响菌体的生长总量，也导致乙醇产量明显降低，因此，初步认为120～160 r·min-1为适宜转速（见图9）。

图7 发酵温度对乙醇产量的影响Fig.7 Effect of fermentation temperature on ethanol yield

图8 发酵时间对乙醇产量的影响Fig.8 Effect of time on ethanol yield

图9 摇床转速对乙醇产量的影响Fig.9 Effect of rotate speed on ethanol yield

2.3.6 发酵的最佳条件

由表5可知，R值的大小分别为A>D>B>C，对乙醇生成产生影响因素从主到次依次为木糖浓度、转速、发酵温度、发酵时间。各因子最佳组合是A3B1C3D2，因此，最佳发酵条件为：木糖浓度20 g·L-1，温度25℃，发酵时间96 h，转速140 r·min-1，乙醇产量达5.5 g·L-1，乙醇得率为理论值59.8%。

表5 正交试验结果Table 5 Results of orthogonal test

3 讨论与结论

本研究筛选出一株产乙醇的菌株，同时结合形态学和现代分子生物学技术对菌株进行鉴定，初步确定为好食脉孢菌。脉孢菌属的酶系丰富，作为丝状真菌既能转化纤维素、半纤维素、淀粉类等物质产生乙醇，又能同时利用葡萄糖和木糖发酵产乙酵，为实现一步法的发酵工艺提供理论基础。本试验结果将为研究好食脉孢菌产乙醇机制奠定基础，同时还可以利用该优良菌株研究混菌发酵制备高催化活性的纤维素酶，鉴于其较高的纤维素酶活力，也能将其利用于混合底物的乙醇发酵，为生物再生能源的开发应用和科学研究提供参考依据。

通过高压富集法从土壤中初步分离筛选得到5株纤维素降解菌株，再以木糖作为唯一碳源的液体培养基进行复筛，得到一株高效代谢木糖产乙醇的菌株，初步鉴定为好食脉孢菌（Neurospora sitophila）。该菌株CMC酶活力为3 554.88 U·g-1、FPA酶活力为506.76 U·g-1，且在紫外灯（30 W，20 cm）下，照射时间8min时，致死率为77.28%，在木糖浓度20 g·L-1、发酵温度25℃、发酵时间96 h、转速140 r·min-1的条件下乙醇产量达5.5 g·L-1，乙醇得率为理论值的59.8%。

[1]Jenfer M H,Chenhui C,Jennifer J,et al.Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa[J].G3Genes Genomes Genetics,2012,2(10):1207-1212.

[2]刘发来,范建平,苏士,等.纤维素生物转化研究进展[J].安徽农业科学,2008,36(17):7059-7060.

[3]Suk J H,Heejin K,Yuping L,et al.Single amino acid substitu⁃tions in HXT2.4 from Scheffersomyces stipitis lead to improved cellobiose fermentation by engineered Saccharomycesces cerevisiae [J].Applied and Environmental Microbiology,2013,79(3):1500-1507.

[4]王丹,张志华,张潇,等.丝状真菌直接转化纤维素生成酒精的研究[J].山东大学学报,2003,38(1):110-113.

[5]王罗琳,丁长河,杨盛茹.纤维素质原料生产乙醇的研究现状[J].农产品加工,2010(4):21-24.

[6]Ryan W,Michael S,Wilfred A,et al.Heterologous Expression, Purification,and Characterization of a Highly Active Xylose Reductase from Neurospora crassa[J].Applied and Environmental Microbiology,2005,71(3):1642-1647.

[7]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:高等教育出版社,2001.

[8]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科技出版社,1979.

Breeding ofNeurospora sitophilato produce ethanol from xylose and optimization of fermentation conditions

HONG Yahui1,2,XIE Weiguo1,2,CHENG Peng1,2,LI Jun1,2
(1.School of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agriculture University,Changsha 410128,China;2.Hunan Provincial Key Laboratory of Phytohormones and Growth Development,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)

Using the high pressure enrichment method,one bacteria strian were separated from soil,which can identified as cellulose degradation strains,and the xylose fermentation characteristics were studied.According to the morphological characteristics and physiological and biochemical characteristics of strains this strian was initially identified as Neurospora sitophila.The strain of CMC enzyme activity of 3 554.88 U·g-1,FPA enzyme activity of 506.76 U·g-1,when ultraviolet irradiation dose 30 W,20 cm distance,the irradiation time of 8 min,the fatality rate was 77.28%.The xylose concentration 20 g·L-1,25℃fermentation temperature,fermentation time 96 h,under speed 140 rmp of ethanol production could reach 5.5 g·L-1,the ethanol yield for 59.8%of the theoretical value.

Neurospora sitophila;Xylose;fermentation;ethanol;ultraviolet mutagenesis

S646.9

A

1005-9369（2014）01-0070-07

2013-07-22

国家973计划课题（2012CB723004）；湖南省教育厅一般项目（12C0164）；湖南农业大学青年科学基金（11QN11）；作物种质创新与资源利用国家重点实验室培育基地开放项目（11KFXM09）

洪亚辉（1955-），女，教授，博士，研究方向为细胞生物学。E-mail:yahuihong@vip.sina.com

时间2014-1-9 19:31:27[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140109.1931.003.html

洪亚辉,谢伟国,程鹏,等.利用木糖发酵生产乙醇的好食脉孢菌选育及其发酵条件的优化[J].东北农业大学学报,2014,45(1):70-76.

Hong Yahui,Xie Weiguo,Cheng Peng,et al.Breeding ofNeurospora sitophilato produce ethanol from xylose and optimiza

tion of fermentation conditions[J].Journal of Northeast Agricultural University,2013,44(1):70-76.(in Chinese with English

abstract)