高效固氮大豆根瘤菌株的筛选研究

王 浩，王绍东，李远明，姜 妍，刘 伟，于 佳

（东北农业大学国家大豆工程技术研究中心，哈尔滨 150028）

高效固氮大豆根瘤菌株的筛选研究

王 浩，王绍东*，李远明，姜 妍，刘 伟，于 佳

（东北农业大学国家大豆工程技术研究中心，哈尔滨 150028）

研究通过蛭石筛选，田间小区试验对黑龙江省3个主栽大豆品种黑农35、合丰40和绥农14进行高效根瘤菌株的筛选，筛选出1株慢生大豆根瘤菌HDD12（Bradyrhizobium japonicum）和快生大豆根瘤菌HDD5 （Sinorhizobim fredii）。其中HDD12在合丰40和黑农35上接种效果较好，均好于施肥处理和空白对照处理。HDD5在绥农14上接种效果较好，但不如施肥对照处理。通过对产量构成情况进行分析，发现单株荚数的增加是接种根瘤菌处理产量增加的主要因素。

大豆；根瘤菌；高效固氮；筛选

大豆是豆科植物，属于一年生草本，喜温、耐阴性植物，是我国重要的粮油兼用作物。大豆根系能够分泌类黄酮等信号分子，诱导土壤中的根瘤菌对其进行侵染、定殖，最终分化形成具有固氮活性的组织—根瘤，能够将空气中的氮转化为可以被大豆生长利用的氮素养料[1]。

大豆与根瘤菌之间共生关系的建立受一系列因素影响，土壤酸碱度及不同品种都会对根瘤菌的种群结构产生影响[2-5]。在中国，能够与大豆结瘤的根瘤菌主要有慢生根瘤菌属中的Bradyrhizobium japonicum、B.elkanii、B.liaoningense和B.yuanmingense，中华根瘤菌属中的Sinorhizobium fredii，以及中慢生根瘤菌属中的Mesorhizobium tianshanense[6]。而在非原始宿主中，林榕姗等发现一株分离自苜蓿的根瘤菌S.meliloti XJ96077也能与大豆结瘤[7]。在巴西，发现能与大豆结瘤的根瘤菌Rhizobium tropici和R.sp.[8]。研究结果表明，大豆根瘤菌的分布具有一定的生物地理特性，即不同生态环境会对大豆根瘤菌分布特性产生影响。

黑龙江省作为我国大豆的主要产区，对黑龙江省大豆主栽品种进行高效大豆根瘤菌的筛选研究，获得具有高效固氮能力的菌种，将为今后开展针对性的施用根瘤菌肥料以及开发利用优良的菌种资源提供技术支持[9-11]。

1 材料与方法

1.1 大豆品种及菌株

所选用大豆品种为黑龙江省主栽大豆品种：黑农35、合丰40和绥农14。所用菌种为分离自这3个大豆品种的根瘤菌，其中8株属于快生根瘤菌（S.fredii），编号分别为：HDD1，HDD2，HDD3，HDD4，HDD5，HDD6，HDD7，HDD8；12株属于慢生根瘤菌（B.japonicum），编号分别为：HDD9，HDD10， HDD11， HDD12， HDD13， HDD14，HDD15， HDD16， HDD17， HDD18， HDD19，HDD20，另外以USDA110为阳性对照，不接菌处理作为阴性对照。

1.2 蛭石筛选

1.2.1 种子消毒催芽

大豆种子经仔细挑选（取种粒饱满，种皮完整）后，95%乙醇浸泡30 s，直接放入0.1%升汞中，浸泡消毒4 min，取出，反复用大量的无菌水冲洗7次，最后浸泡在刚好没过豆粒的无菌水中浸泡2 h，至种子完全吸胀后，摆入水琼脂平板中，倒置，28℃，黑暗处，催芽3 d。

1.2.2 菌液培养及接种浓度

供试菌株用TY液体培养基试管培养，选取不同浓度菌液测定OD600吸光值及进行平板计数。通过平板计数的结果确定接种所需的菌体浓度及接种量。

TY液体培养基（g·1 000 mL-1）：胰蛋白胨5，酵母粉3，CaCl2·H2O 0.7,pH 6.8～7.2。

1.2.3 双层钵栽种体系

将蛭石拌低氮营养液，装入一次性塑料杯（底部打孔，穿入纱布条）中，用牛皮纸封口，放置在装满水的玻璃瓶上，间歇式湿热灭菌3 h，待用。

调整菌液浓度，至OD600=2.0（约109cfu·mL-1），将已发芽的大豆种子在菌液中浸泡15 min后栽入灭菌的双层钵体系中，每瓶一粒种子，再用移液器接种2 mL菌液。不同大豆品种接种不同菌株作为一个处理，每个处理5个重复。

1.2.4 生长条件及收获

蛭石盆栽置于温室（温度25℃，光强7 000～8 000 lx，光照时间13 h）中定期浇水。生长至开花期（约45 d）收获植株，测定生物量，并进行数据分析。

1.3 土著根瘤菌数量调查

为了保证接种的根瘤菌在田间具有较强竞争优势，有必要针对接种土壤进行土著根瘤菌数量调查，在小区试验区内较远位置取两点（A点和B点），采集少量耕层土。采用最大或然数法（Most probable number，MPN）对土著根瘤菌进行计数。

将黑农35种子消毒后，催芽处理（同1.2.1），栽入无菌蛭石大试管（40 mm×300 mm），内装拌有低氮营养液的蛭石中（121℃间歇灭菌，每次2 h），接种10-1～10-7稀释度的土壤悬液1 mL，并设置不接种土壤悬液作为对照，每个稀释度4个重复。放置于光照培养箱中7 000 lx，温度维持在15～25℃，光照时间16 h，生长5 w后进行结瘤调查。中间视情况补加无菌水。用MPN法计算单位重量土体中所包含根瘤菌数目。

1.4 小区接种试验

选取蛭石回接中的优势菌株（S.fredii HDD5，分离自合丰40；B.liaoningense HDD12，分离自黑农35）进行小区接种试验。

菌株接种于鸭嘴瓶内YMA固体培养基平面上。28℃培养一周，将菌体用生理盐水洗下，离心收集。取少量菌体稀释，测定OD600吸光值，与平板计数的结果相结合，计算总接种量。

YMA固体培养基配方（g·1 000 mL-1）：甘露醇10，K2HPO40.25，KH2PO40.25，MgSO4·7H2O 0.2，NaCl 0.1，酵母粉0.8，琼脂粉15，pH 6.8～7.0。

试验于东北农业大学阿城畜牧园区内进行。采用随机区组试验设计，重复3次。小区行长5.7 m，垄距40 cm，面积41.61 m2。大豆品种为黑农35、合丰40和绥农14。株距10 cm，人工点播。播种时随即施入根瘤菌肥水剂，接种菌液浓度约为1.5×108cfu·mL-1，每行接1 L菌液，每个小区接种量约为1.35×1012个。追肥处理于大豆初花期追施尿素150 kg·hm-2。小区试验占地约0.2 hm2。5月18日播种，10月8日收获，收获后考种调查产量及主要产量性状。

于2011年5月下旬播种，10月中旬收获。

2 结果与分析

2.1 蛭石筛选结果

对蛭石筛选的植株进行地上部植株干重、鲜瘤重、干瘤重三项指标的测定。每个品种各项指标最优的前四株菌株见表1。

从表1可以看出，B.japonicum HDD12在3个品种中都是优势的共生固氮菌株，在黑农35中，该菌株的接种效果最好。S.fredii HDD5在合丰40和绥农14中是优势菌株。因此，选取在3个品种中普遍的优势菌株HDD12和HDD5作为小区接种试验菌株。

2.2 土著根瘤菌数量测定结果

MPN法测定土著根瘤菌数量的植株结瘤情况见表2。

由此可知，A点的数量指标为4、2、1，查MPN表，可以计算A点每克土中含土著根瘤菌的数量为9.5×102个，B点的数量指标为4、4、2，查MPN表，可得B点每克土中含土著根瘤菌的数量为7.0×102个。土著根瘤菌数量较少，适宜接种根瘤菌。

表1 蛭石筛选结果Table 1 Result of vermiculite screen

表2 MPN法测定土著根瘤菌数量的植株结瘤情况Table 2 Nodulation result of MPN to test the host rhizobium number

2.3 小区接种试验结果

不同处理小区产量的情况见图1。

图1结果表明，对合丰40接种HDD12能够增产，接种HDD12+施肥以及接种HDD5并不增产。对黑农35接种HDD12和HDD5都能够增产，但是HDD12接种效果更好，比CK处理增产35.6%，比施肥处理增产9%。绥农14接种HDD12和HDD5效果均低于施肥对照处理。

图1 小区接种试验产量柱状图Fig.1 Column graph of production in plot experiment

小区接种试验产量构成情况见表3。

从产量构成情况来看，接种根瘤菌对大豆单株荚数的增加较为明显，其中黑农35和绥农14与对照相比差异达显著水平。单株荚数的增加在一定程度上能够提高大豆单位面积的产量。绥农14和合丰40接种处理与对照相比单株空荚数显著减少，其他产量性状与对照相比差异不显著。

通过对各处理产量的分析，考虑试验费用，对各处理的经济效益进行分析。接种根瘤菌的毛收益见图2。

表3 小区接种试验产量构成Table 3 Yield component of plot experiment

图2 小区接种试验不同处理毛收益Fig.2 Gross income of different treatment in plot experiment

由图2可知，小区试验中对黑农35品种接种根瘤菌HDD12经济效益最好，每公顷增加毛收益4 200余元。另外，对合丰40接种HDD12，对绥农14接种HDD5也能够增加收益。

3 讨论

本研究通过蛭石筛选及小区接种试验，筛选与黑龙江省3个主栽大豆品种黑农35、合丰40和绥农14相匹配的根瘤菌菌株，验证根瘤菌接种的增产作用。

通过对不同大豆品种各处理的产量分析发现，与对照相比合丰40接种根瘤菌HDD12增产作用明显，而施肥处理产量略低于对照，这一结果表明，对于大豆施用氮肥并不一定能够增产，在有些情况还可能抑制产量提高。黑农35施肥和接种根瘤菌HDD12均表现出明显的增产趋势，但是接种HDD12的产量要高于施肥处理。另外，HDD12分离自黑农35，说明原宿主品种更有可能分离出高固氮效能的菌株。而对绥农14施用根瘤菌HDD12和HDD5增产效果不明显，施肥处理略好于接种处理，说明所选用的菌株对绥农14田间共生固氮效率并不高。以上结果表明不同大豆品种对根瘤菌及施肥的效果不同，黑农35的接种效果要好于另外两个品种。两种菌株相比较，HDD12的接种效果好于HDD5。

本研究中对不同处理的产量构成情况进行分析发现，接种根瘤菌能够增加大豆单株有效荚数，这一结果与孟庆英等研究结论较为一致[12]。但也有研究表明，接种根瘤菌后大豆荚数减少，粒重和百粒重增加[13]。接种根瘤菌对于大豆产量性状的影响在不同研究中存在不一致性，原因尚待后续研究进一步论证。

4 结论

3个品种接种HDD12平均产量3 657 kg·hm-2，与对照相比增产29.5%；接种HDD5平均产量3 306 kg·hm-2，与对照相比增产6.1%；追施氮肥尿素平均产量3 350 kg·hm-2，与对照相比增产9.0%。说明接种HDD12在3个品种中具有普遍的增产作用，效果好于施肥处理，具有一定推广价值。因此，要继续对该菌株的接种效果进行观测，如果增产效果稳定，可以考虑推广应用。

[1]江木兰,张学江,徐巧珍,等.大豆—根瘤菌的固氮作用[J].中国油料作物学报,2003,25(1):52-53,58.

[2]Man C X,Wang H,Chen W F,et al.Diversity rhizobia associated with soybean grown in the subtropical and tropical regions of China[J].Plant Soil,2008,310:77-87.

[3]Han L L,Wang E T,Han T X,et al.Unique community structure and biogeography of soybean rhizobia in the saline-alkaline soils of Xinjiang,China[J].Plant Soil,2009,324:291-305.

[4]Yang S S,Bellogin R A,Buendia A,et al.Effect of pH and soybean cultivars on the quantitative analyses of soybean rhizobia populations[J].J Biotechnol,2001,91:243-255.

[5]张红侠,冯瑞华,李俊,等.黄土高原地区大豆根瘤菌的遗传多样性和系统发育[J].微生物学报,2010,50(11):1466-1473.

[6]张伟涛,杨江科,袁天英,等.我国南北大豆产区慢生大豆根瘤菌的遗传多样性和系统发育研究[J].微生物学报,2006,46: 127-131.

[7]林榕姗,杜秉海,李晓红,等.一株能在大豆上结瘤的苜蓿中华根瘤菌[J].微生物学报,2004,44:729-733.

[8]Hungria M C,Megias M O,Lamrabet M,et al.Genetic diversity of indigenous tropical fast-growing rhizobia isolated from soybean nodules[J].Plant Soil,2006,288:343-356.

[9]王晶,许修宏.不同根瘤菌、大豆品种、土壤类型对固氮酶活性的影响[J].东北农业大学学报,2008,39(9):36-39.

[10]黄芳,许修宏.不同类型土壤中大豆与根瘤菌的匹配性研究[J].东北农业大学学报,2007,38(2):211-214.

[11]李继存,赵云,赵恩海,等.根瘤菌拌种对大豆主要性状及其产量的影响[J].山东农业科学,2011(7):92-93.

[12] 孟庆英,张春峰,于忠和,等.根瘤菌对大豆根际土壤微生物及大豆农艺性状的影响[J].大豆科学,2012,31(3):498-500.

[13]王庆胜.根瘤菌对大豆产量及品质的影响[J].黑龙江农业科学,2010(9):138.

Screen of the high nitrogen fixation activity rhizobium with soybean

WANG Hao,WANG Shaodong,LI Yuanming,JIANG Yan,LIU Wei,YU Jia(National Research Center for Soybean Engineering and Technology,Northeast Agricultural University,Harbin 150028, China)

By using the vermiculite pot culture and plot experiment to screen the high nitrogen fixation activity rhizobium with three popular soybean cultivars of Heilongjiang Province that are Heinong35,Hefeng40 and Suinong14.The slow growing soybean rhizobium HDD12(Bradyrhizobium japonicum)and fast growing soybean rhizobium HDD5(Sinorhizobim fredii)were performed well. HDD12 could increase the production of Hefeng40 and Heinong35 than the treatments of fertilizer treatment and blank control.HDD5 could increase the production of Suinong14,but less than the treatment of fertilizer.By analyzing the yield component,we found that pot number was the major factor of production increase.

soybean;rhizobium;high nitrogen fixation;screen

S565.1；Q939.11+4

A

1005-9369（2014）03-0015-05

时间2014-3-21 9:10:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140321.0910.007.html

王浩,王绍东,李远明,等.高效固氮大豆根瘤菌株的筛选研究[J].东北农业大学学报,2014,45(3):15-19.

Wang Hao,Wang Shaodong,Li Yuanming,et al.Screen of the high nitrogen fixation activity rhizobium with soybean[J]. Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(3):15-19.(in Chinese with English abstract)

2013-11-29

黑龙江省青年科学基金项目（QC2013C013）；哈尔滨市科技局青年科技创新人才项目（2013RFQQJ173）；东北农业大学博士启动基金项目（2010RCB72）；东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室开放基金项目（SB12B03）

王浩（1980-），女，助理研究员，博士，研究方向为生物固氮及土壤微生物学。E-mail:21066849@qq.com

*通讯作者：王绍东，副研究员，研究方向为大豆育种及品质改良。E-mail:wsdhlj@aliyun.com