广西百色地区结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB的突变特征分析①

韦红玉，隆昕颖，凌俊，赵丽娟②，谢振锋，唐华英，韦连登，陈源红，覃艳春

（1.右江民族医学院病原生物学与免疫学教研室，广西 百色 533000

E-mail：why-825＠163.com；2.广西百色市疾病预防控制中心，广西 百色 533000；3.广西百色市妇幼保健院，广西 百色 533000）

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的慢性传染病，我国仍是22个结核病高负担国家之一。近年来，我国每年报告肺结核发病人数约100万，导致结核病高发病率和死亡率的重要因素之一是耐药结核病的产生，耐药肺结核有以下4种类型，单耐药（monoresistance）：仅对1种抗结核药物耐药；多耐药（polyresistance）：对1 种以上的抗结核药物耐药（不包括同时对异烟肼和利福平耐药的情况）；耐多药（Multidrug resistance，MDR）：至少对异烟肼和利福平同时耐药；广泛耐药（Extensively drug-resistant，XDR）：除对异烟肼和利福平耐药之外，同时对任意1种氟喹诺酮类药物及对3种二线抗结核药物注射剂（卡那霉素、丁胺卡那霉素和卷曲霉素）中的至少1种耐药［1］。目前耐药肺结核危害日益凸显，每年新发患者人数约12万，未来数年内可能出现以耐药菌为主的态势。因此耐药结核病一直都是临床治疗的难点和基础研究的热点［2］。近年来世界各地结核分枝杆菌的多耐菌株逐渐增多，甚至引起暴发流行。利福平是传统的抗结核一线药物，结核分枝杆菌对利福平的耐药机制可能是，编码RNA 聚合酶beta亚基的rpoB 基因的突变使利福平不能与之结合，从而产生对利福平的耐药［3］。目前很多预测利福平耐药的分子检测方法已经建立起来［4-5］，以往研究［6-9］显示单耐利福平菌株的rpoB基因突变多分布在“利福平耐药决定区”（rifampin resistance determining region，RRDR），507-533 位 密 码 子，共81 bp。

本研究拟了解百色地区耐利福平结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因RRDR 突变特征及其与耐药的关系。为本地区耐药结核的防治和制订有效的预防及干预耐药结核病措施提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2013年在百色市疾病控制中心结核病防治所就诊的结核病痰液涂片阳性128例患者（包括百色市及百色地区各县新发和复发患者，年龄19～88岁；男96例，女32例）的痰标本。

1.2 方法

1.2.1 结核分枝杆菌培养及耐药性检测 痰液涂片阳性细菌采用改良的罗氏培养基分离培养，培养阳性的菌株采用绝对浓度法进行耐药性检测。

1.2.2 基因组DNA 提取和rpoB基因RRDR 的PCR 扩增和测序 基因组DNA 采用北京andybio公司生产的分枝杆菌DNA 提取试剂盒（柱式）提取，rpoB基因扩增引物为rpoB-F：5′-TACGGTCGGCGAGCTGATCC-3′，rpoB-R ：5′-TACGGCGTTTCGATGAACC-3′［10］（引 物 由 华 大 基 因 公 司合成），序列大小为411bp。PCR 扩增采用50μl反应体系：5 μl模板，上下游引物各1.5μl，ddH2O 17μl，2×EasyTaq PCR SuperMix 25μl（购自北京全式金生物公司）。扩增程序为：95℃变性5min；94℃变性1min，58.5℃退火1min，72℃延伸1 min；循环30次，最后72 ℃延伸10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 DNA 序列测定与分析 PCR 产物交由上海生工生物工程有限公司进行测序。用BLAST 与H37RV 菌株相应基因进行序列比对，通过DNAman软件判断突变基因突变位点及形式。

2 结果

2.1 分离培养结果 从128例痰液涂片阳性标本中分离培养获得98例MTB菌株，36株对利福平耐药。

2.2 PCR 检测结果 提取耐药菌株DNA 进行PCR，PCR 扩增产物与目的片段大小一致，部分PCR 产物电泳图谱见图1。2.3 测序比对结果 36株耐药菌株中，27株在rpoB“RRDR”区域出现突变，突变位点有4个，rpoB 单个突变位点突变特征，见表1。

图1 耐药菌株PCR 产物电泳图

表1 rpoB突变位点突变特征

3 讨论

耐利福平MTB rpoB 基因突变主要发生在“RRDR”，以531、526、516位突变最为多见。已有文献报道我国北京市等8个地区MTB rpoB基因突变情况［11-12］，而百色地区尚未见类似报道。本研究检测结核病患者痰标本rpoB基因RRDR 突变及其性质，为在我地区建立快速检测耐利福平结核病基因诊断技术奠定基础。

本实验98 例 MTB 出现36 株利福平耐药，耐药率为36.73%，检测耐药菌rpoB基因序列，36株耐利福平菌株中有27株rpoB基因发生突变，基因突变率为75.00%，与贵州省遵义 地 区rpoB 基 因 突 变 率 相 似［11］，其 中516 位 点 突 变 率为3.70%（1／27），531 位 点 突 变 率 为59.26%（16／27），526 位点突变率为29.63%（8／27），533位点突变率为7.41%（2／27）。与常规药敏实验相符。531位点突变率与东部地区rpoB531突变频率（61.2%）［13］及中部地区rpoB531突变频率（58%）［14］研究结果相近，该研究中较高的rpoB531 突变频率也可能是由于耐药菌株对于rpoB531的选择压力造成的［15］。有报道，531位和526位是最常见的突变位点，且531多于526［16］，与本地区的rpoB基因突变结果一致，但也有报道，526位突变频率高于531位突变频率［3，17］，另本实验未出现已报道的522、550、511、513突变位点，说明rpoB基因突变位点在我国有一定的地域差异。本实验说明百色地区耐利福平结核分枝杆菌耐药性的产生主要是因为rpoB 的531 位点密码子发生改变，其次是526位点密码子发生改变，与苏州市、广东省、河南省等地突变特征相似［10，18-19］，进一步阐明利福平耐药机制主要与基因突变有关，特别是与531位点突变相关。9株未发生突变与常规药敏实验不符，说明利福平耐药性的产生可能还有其它耐药机制或常规药敏实验也有误差，或是患者对MTB发挥免疫防御过程中患者自身遗传易感性及免疫系统稳态的打破使机体不能清除MTB而导致耐药［20］。

总之，本研究首次采用DNA 序列测定技术分析百色地区结核分枝杆菌耐利福平rpoB 基因的突变特征，为开发结核分枝杆菌耐药性分子检测方法和阐明MTB利福平耐药机制积累了实验数据。

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