壮医药线点灸联合针挑疗法对大鼠坐骨神经痛相关神经元和递质的影响①

李克明，唐汉庆，黄岑汉，郑建宇，李晓华，窦锡彬，黄春传，赵玉峰，赵秋华

（右江民族医学院，广西 百色 533000）

坐骨神经痛（sciatica）属于神经病理性疼痛（neuropathic pain，NPP），是一种慢性反复性疼痛。临床上坐骨神经痛患者病程较长，少则数个月，多则十余年，给患者带来长期痛苦，给家庭和社会带来沉重的医疗费用负担，寻找费用低廉、效验明确的治疗方式方法值得研究。民族医药中，壮医药线点灸疗法和针挑疗法广泛应用于一些慢性疼痛、疑难病的治疗中，疗效确切，已被临床实践证明［1-2］，而对于其治疗坐骨神经痛的机制研究较少。最近的研究［3］表明γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA）能神经元的氧化损伤是坐骨神经痛发生的重要病理机制，我们在以往实验工作中观察到壮医药线点灸联合针挑疗法能够增强D-半乳糖所致衰老模型大鼠抗氧化酶活性、提高其抗氧化能力，在此基础上，我们建立坐骨神经慢性压迫损伤（chronic constriction injury of sciatic nerve，CCI）大鼠模型，通过壮医药线点灸联合针挑疗法的干预，检测抗氧化／氧化指标超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）的活性或水平，同时观察GABA A 受体（GABAAR）mRNA 表达、神经递质GABA 和5-羟色胺（5-HT）含量以及GABA 能神经元的凋亡变化，从GABA 能神经元氧化损伤的角度初步探讨壮医药线点灸联合针挑疗法治疗坐骨神经痛的机制。

1 材料

1.1 动物 SPF级SD 大鼠80只，雌雄各半，体质量（185.25±6.36）g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2013-0006。动物在安静环境下分笼饲养，室温控制在（23±1）℃范围内，相对湿度60%～70%，大鼠以标准饲料常规饲养，自由饮水。对动物的使用和处理遵循2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》有关条款。

1.2 主要试剂和仪器 SOD（批号20130612）、GSH-Px（批号20130405）、MDA（批号201302065）、ROS（批号201306009）检测试剂盒（均由武汉博士德公司提供）；GABA 检测试剂盒（批号0313635，北京博惠嘉业生物医学公司生产）；5-HT 检测试剂盒（批号02130612，上海生物化学公司生产）；水合氯醛（批号20130013，北京化学试剂公司生产）；Trizol（Gibcobrl公司）；M-MLV（Piomegan公司生产）；Tag酶、DNAmark（北京博奥公司生产）；GABAAR 基因引物（Invitrogen公司生产）；鼠抗GABA 多克隆抗体、二抗兔抗鼠及Tunel凋亡检测试剂盒（美国R＆D 公司生产）。

电子天平（AE160型，瑞士Mettler公司生产）；电动玻璃匀浆机（DY-89 型，宁波新芝公司生产）；超声波细胞破碎机（SONICS型，U.S.A 生 产）；高 速 低 温 离 心 机（PK121R 型，ALC 公司生产）；超低温冰箱（MDF-U72V 型，日本三洋公司生产）；酶标仪（MK3 型，Thermo Labsystem 公 司 生 产）；凝 胶成像系统（chemidoc XRS型，美国伯乐生产）；PCR 仪（7900HT型，ABI公司生产）；紫外分光光度仪（DU530型，Beckman公司生产）；倒置式生物显微镜（DMIL LED，德国莱卡生产）。

2 方法

2.1 动物分组和造模 大鼠适应性喂养3d后，随机数字表法分为4组：正常对照组（简称对照组）、假手术组、模型组、药线＋针挑组（简称联合组），每组20只。模型组、联合组参考文献［4］的改良方法进行CCI造模，造模方法：10% 水合氯醛按3 mL／kg 腹腔注射麻醉，手术部位均选取左侧，常规消毒，沿大鼠左股后外侧纵行切开皮肤大约2cm 长，用止血钳子钝性分离大鼠半腱肌及股二头肌，在肌间缝隙中游离出坐骨神经，并使之充分暴露，多孔胶片包裹结扎部位的神经，然后再用6.0的手术缝合线做四道结扎，间距约1mm，结扎的松紧度以不影响神经外膜的血运为度，关闭切口，缝合皮肤前后分别消毒1次。

假手术组只暴露坐骨神经，不结扎坐骨神经，其余步骤和模型组、联合组的操作相同。对照组不作任何操作。

联合组在造模组造模成功基础上，采用壮医药线点灸联合针挑疗法进行干预，具体如下：根据李忠仁主编的《实验针灸学》取双侧足三里穴位（ST36），拇指和食指手持中号壮医药线（药线直径为0.7mm）在酒精灯或蜡烛上点燃后，熄灭药线明火火焰，此时药线剩下圆珠状炭火星，顺应手腕和拇指的屈曲动作，拇指指腹稳重而敏捷地将有圆珠状炭火星线头直接点压于足三里穴位上，火灭即起称为1壮，每穴每次共灸3壮。每天每穴点灸1次。7d为1个疗程，间隔1d继续下个疗程。同时，取左侧阳陵泉（GB34）、环跳（GB30）穴位。操作：穴位皮肤常规消毒，采用消毒大号缝衣针将上述穴位作为针挑点，用拇指、食指、中指合拢把针握紧，挑出皮下一些白色纤维组织，然后用针在该穴位垂直快速点刺3次，刺入皮下1mm，点刺后以5%碘酒、75%酒精消毒，每天每穴位挑刺1次。7d为1个疗程，间隔1d继续下个疗程。联合组进行连续3个疗程的处理。对照组、假手术组和模型组不作特殊处理。

2.2 大鼠行为学观察 造模后，观察大鼠自主行为，如有否跛行、自噬行为，反应是否敏捷及活动度、摄食行为等。

2.3 指标检测 疗程结束后，处死大鼠。取静脉血2ml，离心（4 ℃，1 000r／min，10min），分离血清，-70 ℃冻存。采用比色法测定血清ROS水平；二硫代二硝基苯甲酸法测定GSHPx活性；黄嘌呤氧化酶法测定血清SOD 活性；硫代巴比妥酸法测定MDA 水平；GABA 和5-HT 检测均严格按说明书操作进行检测。

2.4 GABAARmRNA 表达检测 用RT-PCR 法检测。取脊髓背角组织作为标本，匀浆，取100μl用Trizol试剂提取总RNA，氯仿和异丙醇抽提。紫外分光光度仪和琼脂糖电泳鉴定RNA 的浓度和纯度，取10μl根据逆转录试剂盒说明逆转录合成cDNA，-70℃冻存备用。取5μl逆转录产物进行PCR 扩增反应，并以β-actin 为内对照。GABAAR 基因引物由Invitrogen公司设计合成。PCR 反应条件：95 ℃预变性2min→95 ℃变性10s→65 ℃退火30s→72 ℃延伸35s，共40个循环，最后72 ℃延伸5min。PCR 扩增反应产物经2%琼脂糖电泳，溴化乙啶染色，通过凝胶电泳分析系统读取目的基因灰度值，将目的基因灰度值与β-actin基因灰度值的比值作为目的基因mRNA 的表达量，目的基因mRNA 的表达量＝目的基因灰度值／β-actin基因灰度值。具体序列及扩增长度见表1。

表1 引物序列及扩增长度

2.5 GABA 能神经元凋亡检测 采用Tunel法检测。取脊髓背角组织置于10%中性福尔马林溶液中固定24h，常规脱水，浸蜡包埋，切片捞于APES防脱玻片上（片厚4μm），60 ℃烤箱烘烤2h。按照Tunel凋亡检测试剂盒的说明步骤进行操作，最后二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并拍片。

2.6 统计学方法 数据统计采用SPSS 13.0软件。计量资料用（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q 检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠行为学观察结果 所有大鼠术后精神状态和摄食良好，没有死亡病例，没有出现自噬行为。模型组和联合组造模后第14d大鼠出现左后肢不稳步态，各足趾不能随意展开，大鼠行走时呈现跛行步态，提示CCI造模成功［5］。

3.2 ROS、MDA 水平及GSH-Px、SOD 活性和GABA、5-HT 含量检测结果 4 组ROS水平差异有统计学意义（F ＝87.88，P ＜0.001）；4组MDA 水平差异有统计学意义（F ＝298.31，P ＜0.001）；4 组GSH-Px水平差异有统计学意义（F ＝944.53，P ＜0.001）；4组SOD 水平差异有统计学意义（F ＝407.57，P ＜0.001）；4组GABA 水平差异有统计学意义（F ＝26.89，P ＜0.001）；4组5-HT 水平差异有统计学意义（F ＝42.65，P ＜0.001）；与对照组比较，假手术组各指标差异没有统计学意义（P ＞0.05）；模型组血清ROS、MDA 水平均显著上升，差异有统计学意义（P ＜0.01），GSH-Px、SOD活性和GABA、5-HT 含量均显著下降，差异有统计学意义（P ＜0.01）。与模型组比较，联合组ROS、MDA 水平均显著下降，差异有统计学意义（P ＜0.01），GSH-Px、SOD 活性和GABA、5-HT 含量上升或显著上升，差异有统计学意义（P ＜0.05或P ＜0.01）。以上结果见表2。

表2 各组ROS、MDA 水平及GSH-Px、SOD 活性和GABA、5-HT 含量比较 （±s，n ＝20）

表2 各组ROS、MDA 水平及GSH-Px、SOD 活性和GABA、5-HT 含量比较 （±s，n ＝20）

注：与对照组比较，a：P ＜0.05，b：P ＜0.01；与模型组比较，c：P ＜0.05，d：P ＜0.01

组别ROS（ng／L）MDA（mol／L）GSH-Px（U／ml）SOD（U／ml）GABA（μmol／g）5-HT（nmol／g）对照组26.89±9.86 7.01±1.56 116.36±4.62 201.88±18.65 2.35±0.86 2.89±0.63假手术组25.98±10.32 7.96±1.23 113.29±5.68 219.53±21.32 2.54±0.91 3.01±0.61模型组68.25±9.65b 24.06±3.06b 36.57±3.02b 94.25±8.65b 0.84±0.16b 1.15±0.52b联合组28.54±8.65d 8.05±2.18d 90.11±7.26c 192.23±16.36c 1.86±0.36d 2.56±0.58d

3.3 GABAAR mRNA 表达检测结果 与对照组比较，模型组GABAAR mRNA 表达下降，差异有统计学意义（P ＜0.05）。与模型组比较，联合组GABAAR mRNA 表达上升，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图1。

图1 各组GABAAR mRNA 表达比较（±s，n ＝20）

3.4 GABA 能神经元凋亡检测 细胞核中有棕褐色着染者为凋亡细胞，染色呈棕褐色的细胞呈典型的凋亡细胞形态学改变，细胞变小、变形、细胞核发生固缩现象；而正常细胞的胞核很少染色。模型组呈棕褐色细胞即凋亡细胞较正常组多，联合组凋亡细胞较模型组下降，见图2。

4 讨论

动物模型的制备是进行动物实验研究的前提，我们参考有关坐骨神经痛动物模型的制备研究报道，采取改良的CCI模型制备方法，此种方法具有减少干扰因素，使动物维持痛觉持久，更有利于对动物长期慢性疼痛的观察和研究［4］。

图2 各组GABA 能神经元凋亡形态学比较（Tunel法×40）

关于坐骨神经痛的病理机制研究问题，研究认为ROS通过减少脊髓GABA 的释放而引起，因此，GABA 能神经元的氧化损伤和功能变化是坐骨神经痛重要病理环节［6］，而最近的研究则指出，GABA 能神经元的氧化损伤和功能变化是坐骨神经痛发生的重要病理机制［3］。在临床工作中我们注意到壮医针挑和药线点灸环跳穴、阳陵泉、足三里等对坐骨神经痛疗效确切，但对于其治疗机制的研究还没有开展，我们结合最新的有关坐骨神经痛研究进展，试图通过动物实验研究进行初步探讨。

已有研究［7-8］表明针刺阳陵泉能提高SOD 活性，能够减轻缺血再灌注和MPTP诱导帕金森大鼠模型新纹状体的氧化损伤。同时，研究［9-10］表明针刺和点灸环跳穴、足三里等能提高血清SOD 含量、降低MDA 水平，提示针刺和点灸环跳穴、足三里等穴位具有抗氧化损伤GABA 能神经元的作用。另外有研究显示电针有可能通过增加脊髓内GABA 含量及增强其受体的活动而产生镇痛作用［11］，而5-HT 能激活5- HT2A 受体在GABA 能中间神经元的表达从而增加GABA 含量发挥镇痛作用［12］，GABA 的合成增多 激 活GABA 受体，GABA 受体mRNA 表达增加，对神经元有保护作用［13］。在本实验中观察到，与对照组比较，模型组血清ROS、MDA 水平均显著上升，GSH-Px、SOD 活性和GABA、5-HT 含量均显著下降。与模型组比较，联合组ROS、MDA 水平均显著下降，GSH-Px、SOD 活性和GABA、5-HT 含量上升或显著上升，GABAAR mRNA 表达上升，和上述的有关报道是一致的，提示壮医药线点灸和针挑疗法能提高抗氧化能力、改善GABA 神经元功能的氧化损伤状况，同时，从GABA 能神经元凋亡检测结果分析，推测壮医药线点灸和针挑疗法还可能对GABA 能神经元有保护作用，但需要进一步的实验探讨。

壮医药线点灸和针挑疗法是壮医的特色医疗技法，是在壮医药理论指导下应用的，壮医长期的医疗实践表明药线点灸具有温经、通络、止痛的效果，足三里是常用的壮医强身保健穴位［14］，药线点灸通过疏通人体“龙路”、“火路”，通行血脉、祛邪外出，保持“气血平衡”，达到壮医药理论中“天、地、人”三气同步的健康和谐状态。针挑疗法也是壮医特色疗法，壮医名家黄瑾明认为壮医针挑的鲜明特色在于针挑通过“谷道”、“水道”、“气道”、“龙路”、“火路”五条道路（即“三道两路”）进行传导和调节。壮医专家黄汉儒［15］、庞声航等［16］、王柏灿［17］等认为针挑疗法的作用机制是挑刺可以激发人体正气，将郁滞体内的有形或无形之毒从体表针挑点驱出，达到排毒逐瘀，恢复“天、地、人”三气同步状态。体现了壮医药理论“调气、祛毒”的治疗原则。对药线点灸和针挑疗法的研究目前多集中于临床报道，而关于其治疗疾病的机制研究仍有待更多的关注。

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