牛蒡多糖对K562细胞增殖的抑制及其机制的探讨①

孟宇，吕俊，齐世美

（皖南医学院生物化学教研室，安徽 芜湖 241001 E－mail：mengyu60＠163.com）

多糖作为一种具有特殊生物学活性功能的物质，日益受到重视，其在抗肿瘤、抗病毒、增加免疫等方面具有一定的功能。前期实验已经证实牛蒡多糖对正常小鼠、环磷酰胺致免疫低下小鼠和S180肉瘤小鼠的免疫系统均有增强作用，不同剂量组的抑瘤率均明显提高，同时能提高荷瘤小鼠巨噬细胞产生NO 及吞噬活性［1］，但是牛蒡多糖对K562细胞的抑制作用及机制未见报道。本课题旨在前期实验研究的基础上，应用MTT、RT－PCR 法检测相关指标，初步探索牛蒡多糖是否对K562癌细胞体外增殖具有抑制作用，是否影响凋亡相关基因BCL－2、Bax mRNA 的表达，从而探讨牛蒡多糖对K562细胞抑制作用的可能机制，寻找一种新的能够诱导K562癌细胞凋亡的多糖，作为治疗白血病的天然无毒副作用的药物，为白血病治疗药物的研发提供必要依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器 RPMI－1640培养基 （南京凯基生物）；胰蛋白酶 （合肥志宏）；MTT （合肥志宏生物）；K562细胞株（引自皖南医学院中心实验室）；RNA 提取试剂盒 （合肥志宏）；逆转录一聚合酶联反应 （RT－PCR）试剂盒 （合肥志宏）。CO2培养箱 （Excella Eco－170）；酶标仪 （EPOCH）；倒置显微镜 （OLYMPUS）。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测细胞抑制率 取对数生长期的K562细胞，置于24孔板，于37℃、5%CO2培养箱中培养，每孔加入100μl相应的含药培养基，设置阴性组，在CO2培养箱中培养24h、48h后。每孔加入20μl MTT （5mg／ml），培养箱继续培养4h，弃去培养基，每孔加入100μl DMSO 溶解，摇床10 min轻轻混匀；λ＝490nm，测出OD值，计算抑制率：抑制率＝（1－试验组A490均值／空白对照组A490均值）×100%。

1.2.2 RT－PCR 测定BCL－2、Bax mRNA 的表达 取对数生长期的细胞以2×105／ml均匀接种细胞于6孔板，每孔2 ml。分为阴性对照组和给药组，给药组分别加入牛蒡多糖5 μg／ml、10μg／ml、20μg／ml，作用30min后，所有组均培养48h后，用Trizol一步提取法提取细胞总RNA，紫外光分光光度计测定其浓度和纯度：样品总RNA 浓度根据核酸稀释倍数计算；所用RNA 纯度：其OD260／OD280均在1.8～2.1之间。以cDNA 为模板进行PCR 扩增。以β－actin作为内参照物。经过模板DNA 的变性，模板DNA 与引物的退火，引物的延伸反应后，取反应液5μl进行琼脂糖凝胶电泳。

1.3 统计学处理 实验结果采用SPSS 9.0软件进行方差分析。

2 结果

2.1 牛蒡多糖对K562细胞增殖的抑制作用 牛蒡多糖作用于白血病K562细胞24h后，与对照组相比，牛蒡多糖5μg／ml组和10μg／ml对细胞的抑制率高于阴性对照组，具有统计学意义 （P ＜0.05），而20μg／ml组明显抑制细胞增殖。牛蒡多糖作用于白血病K562细胞48h后，与对照组相比，牛蒡多糖5μg／ml组对细胞的抑制率高于阴性对照组，具有统计学意义 （P ＜0.05），而10μg／ml和20μg／ml组均显著抑制K562细胞的增殖，如表1所示。

表1 牛蒡多糖处理24h、48h后对K562细胞增殖的抑制率 （±s）

表1 牛蒡多糖处理24h、48h后对K562细胞增殖的抑制率 （±s）

注：牛蒡多糖组与阴性组比较，a：P ＜0.05，b：P ＜0.01

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2.2 牛蒡多糖对BCL－2和Bax基因表达的影响 与对照组相比，牛蒡多糖5μg／ml组对BCL－2 基因的表达下调，Bax的表达影响不大；与对照组相比，牛蒡多糖10μg／ml组对BCL－2基因表达明显下调，Bax的表达上调；牛蒡多糖20μg／ml组对BCL－2基因表达明显下调，对Bax的基因表达具有明显的上调作用，见图1。

图1 不同浓度牛蒡多糖对BCL－2和Bax基因表达的影响

3 讨论

目前，环境污染越来越严重，白血病的发病率也逐年上升，尤其是慢性粒细胞白血病 （CML），是一种严重危害生命的造血系统的恶性肿瘤，目前其主要的治疗是传统的姑息治疗和化疗，化疗药物主要有干扰素和阿糖胞苷［2］，但治疗效果随着时间增加而不佳，且存在严重的副作用，同时给病人带来很大的痛苦。目前对牛蒡根的药理活性研究较多，现代研究表明，牛蒡根具有抗菌［3］、抗突变、抗癌［4］、抗衰老［5］等作用。本课题组从牛蒡根中提取牛蒡多糖，并对其从提取工艺到药理学功能等方面进行了研究，发现牛蒡多糖一定剂量灌胃处理能提高小鼠的脾淋巴细胞增殖及IL－2、IFN－γ的分泌［6］，本实验室研究也显示牛蒡多糖对正常小鼠、环磷酰胺致免疫低下小鼠S180 肉瘤小鼠的免疫系统均有增强作用，但牛蒡多糖对白血病的治疗及抑制肿瘤生长的作用机制并未见报道，是否对癌细胞具有凋亡诱导作用不得而知。牛蒡多糖作为一种天然药物，在治疗肿瘤方面有着巨大的研发价值，本课题通过实验确定牛蒡多糖对K562细胞增殖的抑制作用，并初步探讨其机制，Bcl－2家族蛋白成员Bax和Bcl－2在线粒体介导的内源性凋亡通路中起着重要的作用，抗凋亡蛋白Bcl－2可以通过阻止促凋亡蛋白Bax在线粒体膜上的作用而抑制细胞凋亡［7－8］，且Bcl－2／Bax比例大小与细胞是否会发生凋亡有密切关系［9－11］。本实验运用RT－PCR 方法检测Bax和Bcl－2的基因表达，结果显示BCL－2基因表达下调，Bax的基因表达增多，说明牛蒡多糖对K562细胞增殖的抑制作用机制可能与BCL－2 基因表达下调，Bax的表达上调，并且调控Bcl－2／Bax比例有关，其进一步机制有待继续进行研究。

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