Box-Behnken 设计-效应面法优化水红花子中总黄酮和花旗松素的提取工艺

佟苗苗， 初 明， 王添敏， 李 娜， 张 慧， 王月丹， 翟延君*

(1. 辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连116600;2. 北京大学医学部基础医学院，北京100191)

水红花子为蓼科植物红蓼Polygonum orientale L. 的干燥成熟果实，始载于《中国药典》1977 年版，具有散血消癥、消积止痛、利水消肿的功效，用于癥瘕痞块、瘿瘤肿痛、食积不消、胃脘胀痛等症［1］。水红花子主要含有花旗松素、槲皮素、山柰酚等黄酮类成分，本课题组在实验研究中发现，总黄酮有较好的抗肿瘤作用，且黄酮中以花旗松素含有量较高。药理研究表明，花旗松素有降血压，保护缺血、缺氧对脑组织的损伤的功效，以及抗炎、抗病毒、抗辐射、抗突变、抗肿瘤等作用［2-4］。因此本实验以水红花子总黄酮、花旗松素提取率的总评归一值为指标［5］，采用Box-Behnken 设计实验，优选出最佳的提取条件，为水红花子的开发利用提供理论参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂 Agilent 1260 Infinity 高效液相色谱仪，DAD 检测器(美国Agilent 公司)。岛津UV1750 紫外可见分光光度计(日本岛津公司)，电子天平(上海天平仪器厂)。花旗松素对照品(纯度98%，百灵威化学技术有限公司)。乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其他皆为分析纯。

1.2 材料 水红花子Polygoni Orientalis Fructus 购于河北安国药材市场，经本校中药鉴定教研室翟延君教授鉴定为蓼科植物红蓼Polygonum Orientale L. 干燥成熟果实。

2 方法与结果

2.1 水红花子总黄酮的测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取花旗松素对照品适量，加65%乙醇制成质量浓度为24 μg/mL 的对照品溶液R1 (供测定总黄酮用)，加甲醇制成质量浓度为71 μg/mL的对照品溶液R2 (供HPLC 用)。

2.1.2 供试品溶液的制备 精确称取水红花子药材粉末5.0 g，置250 mL 圆底烧瓶中，加65%乙醇100 mL 加热回流60 min，过滤，定容于100 mL 量瓶中。

2.1.3 波长的选择 将供试品溶液和对照品溶液分别进行光谱扫描。结果两者在290 nm 附近有一最大吸收峰，故选择检测波长为290 nm。

2.1.4 标准曲线的绘制 精密吸取R1 对照品溶液2.00、3.75、5.00、7.50、10.00 mL 稀释至10 mL 量瓶中，在290 nm 处测定其吸光值。以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y = 0.036X -0.020，r=0.998 9。表明花旗松素在4.80 ～24.00 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.5 水红花子总黄酮的测定［6-7］精密吸取供试品溶液0.5 mL，定容于50 mL 量瓶中，按照“2.1.4”项的操作，在290 nm 处测定吸收值，代入标准曲线并计算出供试品中总黄酮的量。

2.2 花旗松素的测定

2.2.1 色谱条件 Agilent 色谱柱 (4.6 mm × 150 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-水(B)溶液梯度洗脱(0 ～5 min，5% ～10% A;5 ～10 min，10% ～18% A;10 ～18 min，18% ～28%A;18 ～24 min，28% ～30% A;24 ～34 min)，柱温25 ℃，检测波长290 nm，体积流量1.0 mL/min。

2.2.2 标准曲线的绘制 精密吸取花旗松素对照品溶液(R2)2、4、6、8、10、12 μL 依次注入色谱仪中，测定峰面积。以进样质量为横坐标，峰面积值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y =4 084.5X +48.1，r =0.999 8。表明花旗松素进样量在0.142 ～0.852 μg 范围内，峰面积与进样量呈良好的线性关系。

2.2.3 花旗松素含有量的测定 精密吸取供试品溶液5 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1。按外标法以峰面积计算花旗松素含有量。

图1 花旗松素对照品(A)和水红花子(B)的HPLC 图谱

2.3 星点设计实验

2.3.1 模型拟合 提取因素为提取溶剂乙酸体积分积、提取时间和液料比，因提取次数为非连续变量，不能进行回归处理，提取1 次，分析因素见表1，设计方案及试验结果见表2。

表1 因素与水平

由回归分析表结果可知，乙醇体积分数和液料比对得率有显著影响，回归方程失拟性检验P =0.330 3 ＞0.05，差异不显著;总回归方程P ＜0.01，达非常显著水平，说明该方程与实际情况拟合很好，可利用该模型分析预测最佳提取工艺条件，见表3。

表2 Box-Behnken 试验设计与结果

表3 回归分析结果

2.4 验证试验结果 由简化后的二项式模型进行预测分析，最优工艺为:采用20 倍量66%的乙醇提取1 次，时间为93 min。按最优工艺进行验证，结果见表4。表4 可知，模型是比较可靠的，证明用效应面法来优化水红花子总黄酮和花旗松素工艺是可行的。

表4 预测值与实际值的比较

3 讨论

3.1 已报道的水红花子总黄酮测定的文献中，多以芦丁为对照品［8-9］，但芦丁不是水红花子的异性成分，不能很好地反映药材内在质量［10］。水红花子中含有量较高的花旗松素的最大吸收波长为290 nm，供试品溶液的最大吸收波长为286 nm和318 nm，因此选择最为接近的290 nm 作为测定波长。

3.2 采用紫外分光光度法对水红花子中总黄酮进行测定，方法简便经济、快速、准确可靠，可以用于检测药材中的总黄酮。采用HPLC 法测定其主要成分花旗松素，该方法具灵敏、稳定、专属性强等优点。

3.3 水红花子总黄酮和花旗松素都是该药材的活性成分且含有量相对较高。采用总评“归一值”法将水红花子醇提工艺中的两指标综合起来，并成功建立数学模型进行优化与预测分析。由于响应面优化法采用非线性数学模型拟合，在中心点进行重复性实验以提高实验的精确度，预测值更接近真实值。试验表明，最佳工艺简单、稳定，可行。

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