儿黄缓释双层栓的体外释药特性研究

崔殿波， 赵永伟， 姜继宗， 李 洋， 王艳宏

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040)

宫颈癌在女性恶性肿瘤中的死亡率排第二位，手术、放化疗虽治愈情况良好，但给患者造成的身体危害也很严重，因此，从中药中寻找有效的治疗药物成为了一个重要的研究方向。儿黄散是黑龙江省名中医王秀霞教授在长期临床实践中总结的治疗宫颈癌的有效方剂。现代药理实验亦证明其可通过使宫颈癌前病变细胞正常化，促进细胞凋亡，从而达到阻断宫颈浸润癌发生的作用［1-2］。但散剂在临床应用中存在给药不方便、易污染衣物、药效持续时间短等缺点。针对此不足，本实验将儿黄散研制开发成了具有缓释作用的双层栓剂，外层以黄连中小檗碱为指标，内层以儿茶中儿茶素为指标，通过考察释放介质、包裹材料、释放介质体积、转速对释放度的影响。建立儿黄缓释双层栓体外释放度的测定方法，分别测定和计算儿黄缓释双层栓外层中总生物碱、各生物碱成分(小檗碱、巴马汀、表小檗碱、黄连碱)，内层儿茶中总多酚、各多酚成分(儿茶素、表儿茶素)不同时间累计释放量及对释放数据用释药方程进行拟合。

1 仪器与试药

1.1 高效液相色谱仪(2695-2996 型，美国Waters公司);ZRS-RG 智能溶出试验仪(天津市天大天发科技有限公司)。

1.2 儿茶、黄连、白及、明矾药材购自哈药集团世一堂中药饮片有限责任公司，经鉴定符合《中国药典》 (2010 年版)规定;盐酸小檗碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号 110713-200911);盐酸巴马汀对照品(中国食品药品检定研究院，批号110732-200907);黄连碱对照品(成都曼特斯标准物质中心，批号 MUST-1203712);表小檗碱对照品(成都曼特斯标准物质中心，批号MUST-11022503);儿茶素对照品(中国食品药品检定研究院，批号 110877-201102);表儿茶素对照品(中国食品药品检定研究院，批号110877-201102);透析袋(MW 8000 ～12000，美国Spectrum 光谱医学公司);PEG 400、PEG 4000 (天津市光复精细化工研究所);HPMC(K15M，上海卡乐康包衣技术有限公司);甲醇，乙腈(色谱纯);其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 儿黄缓释双层栓的制备 取处方量黄连、白及、儿茶、明矾。其中，黄连以乙醇提取，提取液回收乙醇后，干燥、粉碎，获得黄连总生物碱细粉;白及以水提取，提取液醇沉后，沉淀物干燥、粉碎，获得白及多糖细粉;儿茶和明矾分别粉碎成细粉后混匀，获得儿茶和明矾细粉。其中黄连总生物碱加入到PEG 4000、PEG 400、HPMC 的混合基质中，充分搅拌，混匀后70 ℃倾入预先涂有液状石蜡的模具中，按每孔1.0 g 倒入栓模，作为栓剂外层;儿茶、白及多糖和明矾加入含3 倍量HPMC相同混合基质中，充分搅拌，混匀后70 ℃倾入栓模中，作为栓剂内层，室温冷却后刮去溢出部分，取出栓剂。

2.2 儿黄缓释双层栓中黄连生物碱类成分HPLC分析方法的建立

2.2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，流动相乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氢钾(50 ∶50) (每100 mL 中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调pH 至4.0)，检测波长345 nm，体积流量1 mL/min，柱温30 ℃。

2.2.2 专属性试验 取儿黄缓释双层栓1 枚，置25 mL 量瓶中，加盐酸-甲醇(1 ∶100)至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，续滤液0.45 μm 滤膜过滤，作为供试品溶液。分别称取105 ℃干燥5 h盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、表小檗碱、黄连碱对照品适量，用盐酸-甲醇(1 ∶100)溶液制成对照品混合溶液。取处方量缺黄连的栓剂同法制成不含黄连生物碱的阴性对照液。分别精密量取上述3 种溶液，注入高效液相色谱仪中，见图1。

图1 儿黄缓释双层栓HPLC 色谱图(黄连)Fig.1 HPLC chromatograms of EHSRS (Coptis chinensis)

结果表明，黄连总生物碱各成分分离良好，阴性对照不干扰。

2.2.3 线性关系考察 用盐酸-甲醇(1 ∶100)溶液分别制备含小檗碱10、40、80、120、160 μg/mL;巴马汀5、10、15、20、25 μg/mL;黄连碱4、8、12、16、20 μg/mL;表小檗碱3、6、9、12、15 μg/mL 的系列对照品溶液。精密吸取对照品溶液各10 μL，依次注入液相色谱仪，色谱条件同“2.2.1”项，测得峰面积。以峰面积为纵坐标，其质量浓度为横坐标，依次得小檗碱回归方程:Y=38 377X - 3 447.6，R2= 0.999 9，线性范围10 ～160 μg/mL;巴马汀回归方程:Y =50 147X -47 157，R2=0.999 9，线性范围5 ～25 μg/mL;黄连碱回归方程Y = 33 788X + 8 515.4，R2=0.999 6，线性范围4 ～20 μg/mL;表小檗碱回归方程Y=22 529X+1 269.4，R2=0.999 7，线性范围3 ～15 μg/mL。

2.2.4 精密度试验 精密吸取上述供试品溶液，重复进样6 次，记录峰面积，小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱的RSD 分别为1.28%、1.77%、2.10%、2.47%，结果表明仪器精密度良好。

2.2.5 稳定性试验 取本品供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样，每次进样10 μL，得小檗碱、巴马汀、黄连碱和表小檗碱的峰面积，其RSD 分别为1.79%、2.31%、1.99%、2.00%。结果表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.6 重复性试验 取儿黄缓释双层栓6 份，精密称定，制成供试品溶液，依法进行测定。结果小檗碱、巴马汀、黄连碱和表小檗碱RSD 分别为0.18%、0.72%、0.74%、0.65%，表明该方法重复性良好。

2.2.7 准确度试验 取已知含量的同一批次供试品，精密称定6 份，向已知含量的样品中分别加入一定量对照品，按供试品溶液制备方法处理后，进样检测。结果表明，小檗碱、巴马汀、黄连碱和表小檗碱加样回收率分别为99.85%、99.52%、99.85%、101.0%，RSD 分别为0.94%、0.68%、0.56%和1.29%，表明该方法有良好的回收率。

2.3 儿黄缓释双层栓中儿茶多酚类成分的HPLC分析方法的建立

2.3.1 色谱条件 DiamonsilC18色谱柱 (5 μm，250 mm×4.6 mm);流动相A 为甲醇，流动相B为0.04 mol/L 柠檬酸-N，N-二甲基甲酰胺-四氢呋喃(45 ∶8 ∶2)，A ∶B (15 ∶85，V/V);体积流量1 mL/min;柱温35 ℃;检测波长280 nm。

2.3.2 专属性试验 取儿黄散双层栓1 枚，置25 mL量瓶中，加适量甲醇-水(1 ∶1)定容，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得供试品溶液。分别称取105 ℃干燥5 h 的儿茶素和表儿茶素对照品适量，用甲醇-水(1 ∶1)溶液制备对照品混合溶液。取处方组成中除儿茶外的其余成分制成不含儿茶的阴性栓，制得阴性对照液。分别精密量取上述3 种溶液，注入高效液相色谱仪中，见图2。

结果表明，儿茶素与表儿茶素分离度良好，阴性对照无干扰。

图2 儿黄缓释双层栓HPLC 色谱图(儿茶)Fig.2 HPLC chromatograms of EHSRS (Catechu)

2.3.3 线性关系考察 用甲醇-水(1 ∶1)分别制备含儿茶素100、200、300、400、500 μg/mL，表儿茶素9.6、19.2、28.8、38.4、48.0 μg/mL 的系列对照品溶液。精密吸取对照品溶液各10 μL，依次注入液相色谱仪，色谱条件同“2.3.1”项，测得峰面积。以峰面积为纵坐标，其质量浓度为横坐标，得儿茶素回归方程:Y =5 490.8X +132 969，R2=0.999 5，线性范围100 ～500 μg/mL;表儿茶素回归方程Y=24 902X+533.2，R2=0.999 6，线性范围9.6 ～48.0 μg/mL。

2.3.4 精密度试验 取“2.3.2”项下供试品溶液，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，进样10 μL，连续进样6 次，记录峰面积。儿茶素与表儿茶素的RSD分别为0.65%、2.20%，结果表明仪器精密度良好。

2.3.5 重复性试验 取同一供试品6 份，每份1枚，按供试品溶液的制备方法操作，测定含量。儿茶素与表儿茶素RSD 分别为1.61%、2.72%，结果表明该方法重复性良好。

2.3.6 溶液稳定性实验 取本品供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h 进样，每次进样10 μL，测定儿茶素和表儿茶素峰面积。RSD 分别为1.21%、1.23%，结果表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.3.7 准确度试验 取已知含量的同一批次供试品，精密称定6 份，向已知含量的样品中分别加入一定量对照品，按供试品溶液制备方法处理后，进样检测。结果表明，儿茶素和表儿茶素平均加样回收率为99.1%和99.8%，RSD 分别为1.09% 和0.53%，表明本方法具有良好的回收率。

2.4 儿黄缓释双层栓的体外释放度研究

2.4.1 体外释放度测定方法的建立 分别取样品各6 枚，外层以小檗碱为指标，内层以儿茶素为指标，参照释放度测定方法(《中国药典》2010 年版(二部)附录ⅩD 第一法)转篮法［3］。温度为(37 ±0.5)℃，分别于0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 h 取样，每次取样2 mL，同时补入等体积同温度的溶出介质，样品经0.45 μm微孔滤膜过滤后进行HPLC 测定。并按以下公式计算不同时间点的累积释放百分率(%)。以累计释放度为纵坐标，取样时间为横坐标，绘制释放曲线。

其中，Cn为各取样点的质量浓度，Ci为0 到t 时间点之前各时间点样品质量浓度之和，M 为样品中小檗碱或儿茶素的总量。

2.4.2 不同释放介质对释放度的影响 分别以0.1 mol/L HCl 溶液、水溶液、pH =6.8 PBS 溶液为释放介质，体积为500 mL，转速为100 r/min，转篮内用微孔滤膜包裹，其他条件及测定方法同“2.4.1”项测定累计释放度。结果见图3。

图3 不同释放介质对释放度的影响Fig.3 Effect of different release media on the dissolution rate of EHSRS

该结果表明3 种介质对药物释放影响不大。考虑到阴道内环境的酸性条件与溶液的配制简单，故选用0.1 mol/L HCl 水溶液为释放介质。

2.4.3 微孔滤膜、透析袋包裹对释放度的影响

分别以微孔滤膜、透析袋包裹，500 mL 0.1 mol/L 盐酸溶液为释放介质，转速为100 r/min，其他条件及测定方法同“2.4.1”项测定累计释放度。结果见图4。

图4 微孔滤膜、透析袋包裹转篮对释放度的影响Fig.4 Effect of different packing materials on the dissolution rate of EHSRS

结果显示无包裹材料的栓剂在2 h 内释放完 全，可能是由于栓剂直接暴露在释放介质中，过度水化，导致药物快速释放，此种条件下很难模拟体内真实环境，无法得出客观的药物释放规律。微孔滤膜组与透析袋组无显著性差异，表明两者均可作为本栓剂的释放条件，考虑到价格的原因，本实验考虑采用较为经济实惠的微孔滤膜。

2.4.4 释放介质体积对释放度的影响 以0.1 mol/L 盐酸溶液为释放介质，体积分别为300、500、900 mL，转速为100 r/min，转篮内用微孔滤膜包裹，其他条件及测定方法同“2.4.1”项测定累计释放度。结果见图5。

图5 释放介质体积对释放度的影响Fig.5 Effect of different volumes of the release medium on the dissolution rate of EHSRS

结果表明，释放介质体积为500 mL 栓剂的内外层4 h 和12 h 的累积释放率为100% ，而释放介质体积为300 mL 栓剂的内外层4 h 和12 h 的累积释放率分别为83.2%和74.6%，释放介质体积为900 mL的栓剂的内外层3 h 和9 h 累计释放率已达到100%，故选择释放介质体积500 mL 为测定条件。

2.4.5 转速对释放度的影响 以0.1mol/L 盐酸水溶液为释放介质，体积为500 mL，转速分别为100、75、50 r/min，转篮内用微孔滤膜包裹，其他条件及测定方法同“2.4.1”项，测定累计释放度。结果见图6。

图6 转速对释放度的影响Fig.6 Effect of different rotation rates on the dissolution rate of EHSRS

实验结果表明，转速越高越有利于药物释放。转速在50、75 r/min 的条件下外层4 h 和内层12 h未释药完全，转速在100 r/min，药物的累计释放率达到100%，故选择转速100 r/min 为释放条件。

2.5 体外释放度的测定

2.5.1 不同时间累计释放度的测定 分别取样品各6 枚，释放介质为500 mL 0.1 mol/L 盐酸溶液为释放介质，包裹材料为微孔滤膜，转速为100 r/min，其他条件及测定方法同“2.4.1”项，分别测定和计算儿黄缓释双层栓外层中总生物碱、各生物碱成分，内层儿茶中总多酚、各多酚成分不同时间累积释放百分率(%)。以累计释放度为纵坐标，取样时间为横坐标，绘制释放曲线。结果见图7。

图7 儿黄缓释双层栓体外释放曲线Fig.7 Dissolution profiles of EHSRS

结果表明制备的儿黄缓释双层栓，外层黄连总生物碱与各生物碱释放行为相似，在4 h 内累积释放100%。内层总多酚与各多酚成分释放行为相似，在12 h 释放完全。

2.5.2 释药模型分析 对外层黄连总生物碱与各生物碱成分，内层总多酚与各多酚成分的释放数据用释药方程拟合，结果见表1、表2。

表1 儿黄缓释双层栓外层总生物碱与各生物碱成分的释药模型拟合方程Tab.1 Model parameters for dissolution of total alkaloids and each alkaloid released from EHSRS

实验结果显示:儿黄缓释双层栓外层黄连总生物碱与各生物碱成分，内层总多酚与各多酚成分的体外释药行为均符合零级方程，且无明显突释现象，体外释放良好，符合《中国药典》2010 版规定的控释制剂释放原则。

3 讨论

儿黄缓释双层栓的剂型设计。儿黄散由黄连、儿茶、明矾、白及组成。由于黄连中的生物碱类成分易与儿茶中的多酚类成分发生配伍变化生成沉淀而影响制剂的成型性，所以，栓剂的剂型首先选择了双层栓，即黄连中的生物碱类成分设计为外层，儿茶中的多酚类成分设计为内层;另外，由于普通的双层栓释放速度过快，所以在普通栓剂中加入了亲水凝胶骨架材料HPMC，使药物的释放趋于平稳，从而延长了药效。

表2 儿黄缓释双层栓内层总多酚与各多酚成分的释药模型拟合方程Tab.2 Model parameters for dissolution of total polyphenol and each polyphenol released from EHSRS

儿黄缓释双层栓中黄连生物碱类成分、儿茶多酚类成分HPLC 分析方法的建立。按照《中国药典》2010 版中黄连和儿茶含量测定方法，分别建立了儿黄缓释双层栓中黄连生物碱类成分、儿茶多酚类成分HPLC 分析方法。结果表明，儿黄缓释双层栓中小檗碱、巴马汀、表小檗碱和黄连碱以及儿茶素和表儿茶素分离度好，专属性强，准确性高。

儿黄缓释双层栓释放度研究中考察指标的选择。中药制剂疗效的发挥是通过多成分、多靶点、多途径的综合作用实现的，所以中药制剂质量控制的模式正由指标成分向有效成分、活性成分，由单指标向多指标，由单成分向大类成分(有效部位)质量控制转变［10-13］。本实验首先分别以小檗碱(外层)和儿茶素(内层)为指标建立了儿黄散缓释双层栓释放度的研究方法，并在此基础上，分别以小檗碱、巴马汀、表小檗碱、黄连碱和总生物碱以及儿茶素、表儿茶素和总多酚为指标，对儿黄散缓释双层栓的释放行为进行了研究。结果表明，儿黄缓释双层栓外层黄连总生物碱与各生物碱释放行为相似，内层总多酚与各多酚成分释放行为相似，均符合零级方程，且无明显突释现象，体外释放良好。就儿黄缓释双层栓而言，以单成分或有效部位为指标均具有可行性。

儿黄缓释双层栓释放度测定方法的建立。缓释栓剂释放度测定一直以来都是个难题，各国药典均未列出统一、规范的方法。文献研究［7-8，14］和预实验的研究结果表明，释放介质体积大小和转篮外是否有包裹材料是建立缓释栓剂释放度测定方法的关键。因此，本实验在确定了以0.1 mol/L 盐酸溶液为释放介质的基础上，考察了释放介质体积为300、500、900 mL，包裹材料为微孔滤膜和透析膜对释放度的影响，进而确定了释放介质为500 mL 0.1 mol/L 盐酸溶液为释放介质，包裹材料为微孔滤膜，转速为100 r/min 的测定方法。该方法具有操作简便、快速的特点，可用于儿黄散缓释双层栓的释放度测定及质量控制，并可为其他缓释栓剂释放度的研究提供有益的参考。

［1］ 陈海丽，韩凤娟，陈惠铮. 儿黄散对Hela 细胞病理形态学变化的影响［J］. 中国妇幼健康研究，2010，21(3):342-344.

［2］ 韩凤娟，隋丽华，张广美. 中医药治疗宫颈上皮内瘤变30例［J］. 中国中医药信息杂志，2003，10(5):55-56.

［3］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典:2010 年版二部［S］. 北京:中国医药科技出版社，2010:附录87.

［4］ Schneeweis A，MuOller-Goymann C C. Controlled release of solid-reversed-micellar-solution (SRMS)suppositories containing metoclopramide-HCl［J］. Int J Pharm，2000，196(2):193-196.

［5］ Azarmi S，Roa W，Lobenberg R. Current perspectives in dissolution testing of conventional and novel dosage forms［J］. Int J Pharm ，2007，328(1):12-21.

［6］ 晋苗苗，郭庆明，蒋 明，等. 银杏内酯缓释片的制备工艺筛选及体外释放度评价［J］. 中国中药杂志，2009，34(15):1910.

［7］ 何 心，石春伟，张 闯，等. 复方甲硝唑缓释栓的制备及体外释放度考察［J］. 中国药房，2011，22 (9):834-836.

［8］ 夏亚子，刘立琼，丁明和，等. 吗啡缓释栓的研制及其体内外释药相关性研究［J］. 中国医药导报，2010，7(5):53-54.

［9］ 刘树扬，冯伟红，杜茂波，等. 中药复方双秦眼用凝胶体外释药性能［J］. 中国实验方剂学杂志，2012，18(8):9-11.

［10］ 彭常春，郑 琴，胡鹏翼，等. 复方丹参多元释药双层片的体外释药研究［J］. 中成药，2010，32(1):39-43.

［11］ 李苑新，袁旭江，朱盛山. 复方丹参缓释片多指标成分体外释放度研究［J］. 中国实验方剂学杂志，2006，12(8):7-9.

［12］ 李苑新，袁旭江，霍务贞，等. 复方丹参缓释片总丹酚酸体外释放度的研究［J］. 中成药，2006，28(5):636-638.

［13］ 张继稳，陈立兵，顾景凯，等. 多组分中药化合物组释放同步性评价方法［J］. 药学学报，2008，43(6):647-651.

［14］ 杨幼旋，志 刚，李 涛. 异烟肼双层栓的研制及药动学［J］. 河北医药，2006，28(3):226-227.

［15］ 严国俊，潘金火，陈 军，等. 中药复方缓释制剂评价方法研究进展［J］. 中成药，2012，33(12):2137-2140.